小鼠DNA模式识别重要受体的分子结构特征及其功能研究

发布时间：2018-05-02 21:39

  本文选题：小鼠 + DNA识别受体　； 参考：《中国农业科学院》2015年硕士论文

【摘要】：天然免疫是宿主抵御病原感染的第一道防线,机体通过自身胚系编码的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),激活一系列信号级联反应,引发Ⅰ型干扰素(interferons, IFNs)、炎症因子(inflammatory factors)、趋化因子(chemokines)等的释放,从而激发机体的抗病原天然免疫反应,最终清除病原。病毒的基因组DNA或转录中间产物是一类重要的PAMPs,因此病毒的DNA如何被机体PRRs识别是宿主能否抵御DNA病毒感染的关键。本研究在克隆小鼠Toll样受体8(TLR8)、小鼠Toll样受体9 (TLR9)、DNA依赖的干扰素调节因子激活物(DAD、黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)和富亮氨酸重复序列互作蛋白1 (LRRFIP1)五种天然免疫DNA模式识别受体的基础上,对其遗传进化关系和分子结构特征进行分析,对模式识别受体的功能进行了初步研究,为深入研究机体抗感染免疫机制和病原免疫逃逸机制等宿主与病原互作奠定了基础。本研究取得的主要进展如下：1.成功克隆和鉴定了5种小鼠DNA识别受体基因。采用RT-PCR技术分别从小鼠外周血淋巴细胞中克隆了其TLR8 (mTLR8)和TLR9 (mTLR9)基因,从脾淋巴细胞中克隆了小鼠DAI(mDAI)、AIM2 (mAIM2)和LRRFIP1 (mLRRFIP1)基因。基因序列分析表明,克隆的mTLR8基因开放阅读框架(ORF)全长3099bp,编码1032个氨基酸；克隆的mTLR9基因ORF全长3099bp,编码1032个氨基酸：克隆的mDAI基因的ORF全长1236 bp,编码411个氨基酸；克隆的mAIM2基因的ORF全长1065 bp,编码354个氨基酸；克隆的mLRRFIPl基因的ORF全长2190bp,编码729个氨基酸。2.预测分析了5种小鼠DNA识别受体基因分子结构特征及其遗传演化关系。利用生物信息学软件对克隆的基因进行分子结构预测分析,结果显示mTLR8含有胞外的亮氨酸富集(LRRs)区、跨膜区和胞内TIR区,且LRRs形成螺线管样的空间结构;mTLR9也含有胞外的亮氨酸富集(LRRs)区、跨膜区和胞内TIR区mDAI含有两个Z-DNA结构域(Za和Zβ)、DNA结构域3(D3)和信号传导结构域(SD)；mAIM2含有HIN-200结构域和PYD结构域；mLRRFIP1含有两个卷曲螺旋结构域,并以二聚体的形式存在。遗传演化分析显示,在哺乳动物中,mTLR8、 mTLR9、mDAI、mAIM2和mLRRFIP1基因分别与各物种的亲缘关系密切,在进化上比较保守。这说明克隆的这些基因均具有模式识别受体的分子结构特征。3.成功克隆了多种天然免疫信号通路效应分子启动子元件序列,构建了其表达报告检测系统。应用PCR技术从小鼠基因组中克隆了小鼠IFN-α2、IFN-α4, IFN-β和TNF-α启动子序列,测序结果表明所扩增启动子序列正确；随后将这些启动子元件序列构建到荧光素酶报告质粒pGL-4.10,测序证实成功构建了pGL-4.10-IFN-α2、pGL-4.10-IFN-α4、pGL-4.10-IFN-β、 pGL-4.10-TNF-α荧光素酶报告质粒。同时,也成功构建了克隆的5种DNA识别受体的表达质粒,并验证了其信号通路报告系统,这为小鼠PRRs的天然免疫模式识别功能监测研究提供了材料和平台。4.成功分析了：mTLR8的组织差异表达特征,初步探讨了其模式识别功能。应用qRT-PCR技术分析了mTLR8的组织表达差异,结果显示mTLR8在小鼠外周血、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠和肌肉中均有表达,但表达量存在差异,其中在肺脏、脾脏和心脏中表达量较高。nTLR8的模式识别功能研究显示,mTLR8的过表达可以启动NF-κB转录,诱导TNF-α的分泌。但mTLR8不能识别R848与poly(dT)的复合物以及富含A/T的DNA序列。这说明小鼠TLR8具有分子结构、转录表达和功能上的特殊性。5.成功分析了小鼠3种胞质DNA识别受体的功能,为DNA受体的信号通路的深入研究奠定了坚实的基础。利用已建立的天然免疫信号通路报告检测系统,分别对mDAI、mAIM2和mLRRFIP1的模式识别功能进行研究,结果显示mDAI、mAIM2和mLRRFIPI分别能够识别富含A/T或C/G的DNA,并通过激活相应的转录因子诱导细胞因子的产生,说明这3种模式识别受体可能在小鼠抗DNA病毒感染的天然免疫中发挥着重要作用。
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本文编号：1835603