梅花鹿VEGF的原核表达与纯化

发布时间：2018-05-04 09:14

本文选题：梅花鹿 + 血管内皮生长因子(VEGF)　；参考：《农业生物技术学报》2017年07期

【摘要】：鹿茸是一个天然的细胞生长因子库,鹿体最活跃的部位是鹿茸顶端组织,里面含有大量的生长因子。这些生长因子可为鹿茸的临床作用研究提供生物化学基础,多种生长因子对鹿茸的增殖具有重要的促进作用。为了获得具有生物学活性的蛋白质,本研究将梅花鹿(Cervus nippon)血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)成熟肽基因与p ET-30a连接构建VEGF基因原核表达载体,鉴定成功后,将p ET-30a-VEGF转入Rosetta大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞进行诱导表达(0.6 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG),20℃,16 h),并对表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)检测。目的蛋白通过Ni-Agarose柱试剂盒进行纯化,通过复性以获得生物学活性。再应用咪唑蓝(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)法检测重组蛋白对小鼠成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast cell line,NIH3T3)的影响。鉴定结果显示,成功构建原核表达质粒;SDSPAGE电泳结果表明,在Rosetta中成功检测到融合蛋白的表达;MTT法结果显示,不同浓度的重组蛋白均能促进NIH3T3的增殖,并且随着浓度的增加,细胞的增殖速度也随之加快;其中,蛋白添加量为200 ng/m L、孵育48 h时,增殖效果较为明显。研究结果将为深入探讨VEGF在鹿茸快速增殖过程中的功能和调控机理提供实验依据。
[Abstract]:Velvet antler is a natural cell growth factor bank, the most active part of deer body is the apical tissue of deer antler, which contains a lot of growth factors. These growth factors can provide biochemical basis for the clinical study of velvet antler, and many growth factors play an important role in promoting the proliferation of velvet antler. In order to obtain the protein with biological activity, the mature peptide gene of vascular endothelial growth factor (VEGF) of Cervus nippon was ligated with p ET-30a to construct the prokaryotic expression vector of VEGF gene. P ET-30a-VEGF was transferred into Rosetta Escherichia coli competent cells to express 0.6 mmol/L isopropyl 尾 -Dthiopyranoside (尾 -D-1-thiogalactopyranoside). The expression product was detected by sodium dodecyl sulfate and polyacrylamide gel electrophoresis with sodium dodecyl sulfate and polyacrylamide gel electrophoresis. Objective protein was purified by Ni-Agarose column kit and renatured to obtain biological activity. Then the effect of recombinant protein on mouse embryonic fibroblast cell lineage NIH3T3 was detected by the method of imidazolium 5-dimethyl-2-thiazolyl- 2-diphenyl-2-H-tetrazolium bromidet MTTs. The results showed that the expression of the fusion protein was detected successfully in Rosetta by SDS-PAGE. The results showed that the recombinant protein of different concentrations could promote the proliferation of NIH3T3, and with the increase of the concentration, the recombinant protein could promote the proliferation of NIH3T3. The proliferation rate of the cells was accelerated with the addition of 200 ng/m / L protein, and the proliferation effect was obvious when incubated for 48 h. The results will provide experimental basis for further study on the function and regulation mechanism of VEGF in the process of rapid growth of velvet antler.
【作者单位】：吉林农业大学生命科学学院;
【基金】：国家自然科学基金项目(No.31572372和No.30972083) 国家级大学生创新创业训练计划项目(No.201510193034)
【分类号】：S825

【参考文献】

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