猪呼吸道上皮细胞抗病毒miRNAs鉴定

发布时间：2018-05-06 05:11

  本文选题：抗病毒miRNAs + 猪呼吸道上皮细胞　； 参考：《东北农业大学》2017年博士论文

【摘要】：猪呼吸系统疾病(Swine respiratory diseases,SRD)严重威胁着养猪业的健康发展,它的致病机理复杂,可以由一种或多种病毒、细菌、寄生虫引起,也可随着环境、营养、应激和猪只自身健康程度的变化而改善或加重。病毒是SRD的主要病原菌之一,天然免疫系统通过模式识别受体(Pattern recognition receptor,PRR)与病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern,PAMP)相互作用,识别病毒并启动相应信号转导通路,启动合成干扰素、白细胞介素等细胞因子及一系列下游抗病毒相关分子,抑制病毒在体内的增殖。上皮细胞不仅是病原微生物入侵呼吸道的物理屏障,还能启动天然免疫反应抵御病毒入侵,是防御呼吸道疾病的第一道屏障。miRNAs是生物体内的一类长度约21~25nt的非编码小RNA,通过在转录后水平调控基因表达而参与各项生命活动,已有研究表明miRNAs与机体的疾病抗性/易感性密切相关。解析呼吸道上皮细胞抗病毒天然免疫反应的分子机制,鉴定抗病毒相关miRNAs及其作用,是防治呼吸道疾病的关键。大多数病毒的PAMP是双链RNA(Double-stranded RNA,dsRNA),人工合成的ds RNA Poly(I:C)能够有效地激活机体的抗病毒天然免疫反应。因此,本研究利用Poly(I:C)刺激原代培养的猪呼吸道上皮细胞,通过高通量测序技术分析对照组和刺激组miRNAs的表达和编辑情况、鉴定新miRNAs,在此基础上,选择感兴趣的miRNAs进行靶基因鉴定和诱导表达、组织表达分析,并分析了miR-20a对细胞生长、迁移、自噬及炎性细胞因子表达的影响,得到的主要结果如下:(1)利用组织块原代培养法和差速贴壁纯化法,成功获得了猪呼吸道上皮细胞,经角蛋白CK18单克隆抗体鉴定,确定为上皮类型的细胞,且纯度较高。(2)经HiSeq高通量测序,对照组和处理组各得到13,339,772和11,987,962条纯净序列,序列长度集中在18~26 nt之间,峰值位于22 nt;获得差异表达显著的miRNAs 23个(p0.01,│log2ratio│1),其中19个在Poly(I:C)刺激下下调表达,4个上调表达。利用MIRANDA、TARGETSCAN和PICTAR三个软件,共同预测到386个基因是差异表达的miRNAs潜在靶序列,这些靶基因主要富集在细胞生长调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子的正负调控、胚胎发育、细胞信号传导等生物过程方面(p0.05)。(3)随机选取两个差异表达miRNAs(miR-101和miR-20a),利用双荧光素酶报告基因分析和定点突变方法对生物信息学预测的潜在靶基因进行实验验证,结果发现miR-101能有效地抑制所选取的所有潜在靶基因(SOX9,TLK2,RANBP9,BCL9,EZH2,SOCS5,CDH11和DR1)的表达,在选取的8个潜在靶基因中,miR-20a能对其中的5个(HLF,ITGB8,ARID4B,SLC40A1和MAP3K2)进行调控,对ENNP5,FBXL5和GPR6基因的表达无影响。(4)测序表明miRNAs中存在大量的碱基编辑现象,处理组和对照组分别有78和87个miRNAs发生编辑,占所检测到miRNAs总数的57.35%和62.14%,碱基编辑包含所有的碱基替代类型,其中以AG碱基编辑形式最多,在对照组和处理组中分别占27.89%和29.38%,其次为GA(12.2%和12.59%)和GT(11.39%和11.9%)。Poly(I:C)处理对碱基编辑产生一定的影响:对照组和处理组中各存在14种和5种特有的碱基编辑现象;miRNAs成熟序列5’端第5个碱基的编辑也在对照组和处理组中表现出差异。双荧光素酶报告基因和定点突变实验表明,第5个碱基编辑对miRNAs识别和结合靶基因具有重要影响,当突变掉第5个碱基(G/T)后,miR-101失去了对靶基因的识别、结合能力。(5)在处理组和对照组中分别检测到83条和82条新的miRNAs,其中47个在两组中共同存在。物种间保守性分析显示,共有19个新miRNAs可以在其他物种中找到同源序列,随机选取其中的6个新miRNAs(NS-1、NS-2、NS-3、NS-6、NS-8和NS-9)进行克隆测序,证明了这些miRNAs确实存在于猪中。诱导表达分析发现,NS-2、NS-8和NS-9在不同浓度Poly(I:C)刺激下表达量变化显著(p0.05);组织表达分析发现,NS-2、NS-8和NS-9在1月龄民猪13个组织中(心、肝、脾、肺、肾、胃、舌、膀胱、小肠、大肠、脂肪、背最长肌和皮肤)均表达,但表达模式各不相同。(6)细胞生长曲线实验证明,过表达miR-20a可以缩短pk15细胞在生长迟缓区停留的时间,提前进入对数生长阶段,显著促进细胞的增殖(p0.05),抑制miR-20a的表达会显著减缓细胞的增殖(p0.05);细胞划痕试验证明过表达miR-20a后,各观测时间点pk15细胞的相对迁移率均显著高于对照组(p0.05),抑制miR-20a的表达会显著降低细胞的迁移率(p0.05)。(7)Real-time PCR检测miR-20a对5个细胞因子(IFN-β、IL-29、IL1-β、IL-6和IL-10)表达的影响,结果发现在pk15细胞中过表达miR-20a,可以显著抑制这些基因的表达(p0.05),抑制miR-20a的表达,可以显著促进这些基因的表达(p0.05)。(8)利用血清饥饿法诱导pk15细胞发生自噬,研究miR-20a对细胞自噬的影响,发现过表达miR-20a后,自噬标记蛋白LC3Ⅱ的表达显著降低(p0.05);抑制miR-20a的表达后,LC3Ⅱ的表达显著升高(p0.05)。
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本文编号：1850923