表达外源基因的REV病毒的构建、拯救及其特性研究

发布时间：2018-05-06 22:24

  本文选题：禽网状内皮组织增生症病毒 + 外源基因与Env融合　； 参考：《扬州大学》2017年硕士论文

【摘要】：禽网状内皮组织增生症病毒(REV)属于反转录病毒科禽类C反转录病毒。REV主要引起以网状内皮细胞增生为主要特征的一组综合征,包括急性网状细胞增生症、矮小综合征和淋巴组织及其它组织的慢性肿瘤增生性疾病。反转录病毒作为外源基因表达及传递载体已有大量研究报道,而REV能否作为外源基因表达载体鲜有报道。本研究首先在REV病毒基因组Env基因的N端插入绿色荧光蛋白基因EGFP,构建并拯救出表达EGFP的REV病毒的基础上,将H9流感病毒HA上部分抗原表位插入Env基因的N端,拯救出表达HA抗原表位蛋白的REV病毒,并进行相关病毒特性研究。1、表达绿色荧光蛋白的REV病毒的构建与拯救为尝试REV能否作为病毒载体表达外源基因,并探究外源基因插入位点,本研究利用重组酶ExnaseTMⅡ克隆技术以及反向遗传操作技术,首先将外源基因EGFP插入REV病毒基因组Env基因N端构建外源基因与Env蛋白融合表达的REV传染性克隆,命名为rREV-EGFP-Env。将rREV-EGFP-Env传染性克隆转染DF1细胞进行了病毒拯救,并通过荧光证明获得了表达EGFP-Env的重组REV病毒。研究结果表明,REV基因组Env基因N端能作为外源基因插入位点用来进行外源基因与Env蛋白的融合表达。这为进一步开发REV作为病毒疫苗载体表达外源基因提供了可能。同时,能够表达EGFP-Env的重组REV病毒的获得可以准确有效的跟踪REV病毒的复制,为研究REV的致病机理和组织嗜性提供有力工具和生物材料。2、表达H9流感病毒HA抗原表位蛋白的REV病毒拯救及其特性为了进一步探究REV作为病毒疫苗载体表达外源基因的可能性,将H9流感病毒HA部分抗原表位插入REV病毒基因组Env基因N端,成功构建HA抗原表位与Env蛋白融合表达的REV传染性克隆,命名为rREV-HAep-Env。将rREV-HAep-Env转染DF1进行了病毒拯救,并通过PCR、IFA和Western blot分析证明获得了表达HAep-Env的重组REV,命名为REV-HA。体外生长曲线测定表明,REV-HA在DF1细胞上的生长特性与REV野毒类似。鸡感染性试验发现,在感染七周内REV组和REV-HA组的鸡体重变化情况类似。抗体检测发现,感染后第二周,REV组和REV-HA组均能产生REV抗体,到第三周抗体水平达到高峰。在感染后第七周,进行了 H9流感病毒的攻毒试验。棉拭排毒测定发现,在感染后第二天,REV-HA组的排毒量明显低于REV组和PBS组。这些结果表明,融合表达H9流感病毒HA抗原表位的REV-HA具有与REV野毒类似生物学特性,同时提示REV作为病毒疫苗载体表达外源基因的可行性。
[Abstract]:Avian reticuloendotheliosis virus (Rev) is a group of syndromes mainly characterized by reticuloendothelial cell proliferation, including acute reticular cell hyperplasia, which is mainly caused by C retrovirus of the family Retroviridae. Dwarf syndrome and chronic neoplastic disease in lymphoid and other tissues. It has been reported that retrovirus can be used as expression vector of exogenous gene, but whether REV can be used as expression vector of exogenous gene is rarely reported. In this study, the N terminal of Env gene of REV virus was inserted into the N terminal of Env gene of REV virus, and then the REV virus expressing EGFP was constructed and saved. Some epitopes of H9 influenza virus HA were inserted into the N terminal of Env gene. The REV virus expressing HA epitope protein was rescued, and the related virus characteristics were studied. 1. The construction and rescue of REV virus expressing green fluorescent protein was to try to find out whether REV could be used as a viral vector to express foreign gene. The insertion site of exogenous gene was investigated, and the recombinant enzyme ExnaseTM 鈪，

本文编号：1854175