PlcR在炭疽芽胞杆菌中的研究
本文选题:plcR + 炭疽芽胞杆菌 ; 参考:《海南大学》2015年硕士论文
【摘要】:PlcR是蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌中十分重要的多效调控因子,多种毒力因子编码基因的表达都由它激活,例如磷脂酶、蛋白酶和溶血素等。改变plcR基因的序列可使蜡样芽胞杆菌与苏云金芽胞杆菌中的溶血素和细胞毒素的表达与活性减弱。比较基因组学显示,炭疽芽胞杆菌中的plcR基因序列是与蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌同源的,但plcR基因在炭疽芽胞杆菌当中发生了一个无义突变,导致在炭疽芽胞杆菌中PlcR不能够正常表达。为了研究plcR基因对炭疽芽胞杆菌功能的影响,本研究主要以蜡样芽胞杆菌CMCC63301基因组为模板构建了pBE2A/A16R、 pBE2A-FplcRpapR/A16R、 pBE2A-papR/A16R、 pBE2A/B17DD、 pBE2A-plcR/B17DD、 pBE2A-plcRpapR/B17DD、 pBE2A-papR/B17DD、pBE2A-FplcRpapR/B17DD十个菌株对其进行表型分析,对其中的pBE2A/A16R、 pBE2A-plcR/A16R、 pBE2A-FplcRpapR/A16R、 pBE2A-plcRpapR/A16R、pBE2A-papR/A16R进行了蛋白质组学研究,并单独对pBE2A/A16R、 pBE2A-plcR/A16R及pBE2A-FlcRpapR/Al6R中的atxA、 sph、 plc三个基因在转录水平上进行了研究。结果显示,单独将papR和plcRpapR全基因序列导入炭疽芽胞杆菌后重组菌株pBE2A-plcRpapR/A16R、 pBE2A-papR/A16R、 pBE2A-plcRpapR/B17DD、 pBE2A-papR/B17DD与重组菌株pBE2A/A16R、 pBE2A/B17DD一样其溶血活性及卵磷脂酶活性均没有恢复。重组菌株pBE2A-plcR/A16R、 pBE2A-plcR/B17DD的溶血活性没有恢复,恢复了部分卵磷脂酶活性,而pBE2A-FplcRpapR/A16R、 pBE2A-FplcRpapR/B17DD重组菌株的溶血酶活性及卵磷脂酶活性均恢复。表明将蜡样芽胞杆菌的plcR单独基因导入炭疽芽胞杆菌后,可以直接激活部分卵磷脂酶活性,但不能激活溶血酶活性;将融合基因FplcRpapR导入炭疽芽胞杆菌后,溶血酶及卵磷脂酶活性均恢复,但pBE2A-FplcRpapR/A16R重组菌株的溶血活性没有pBE2A-FplcRpapR/B17DD稳定。PlcR蛋白的表达受自身所调控,其较为保守的N端,属于DNA结合区域,在plcR调控基因的启动子区域存在高度保守的回文序列TATGNANNNNTNC ATA,我们推测他可能构成了plcR的识别位点(即PlcR-box),根据该回文序列我们查找出92个可能受PlcR调控的蛋白,通过对pBE2A/A16R、 pBE2A-plcR/A16R、 pBE2A-FplcRpapR/A16R、 pBE2A-plcRpapR/A16R、 pBE2A-papR/A16R蛋白质组学的研究,在我们查找的差异蛋白中有4个蛋白是受PlcR调控的。在转录水平上分析了atxA和plc、 sph等与溶血素、卵磷脂酶相关的基因,plc、 sph基因的相对表达量与溶血活性及卵磷脂酶活性呈正相关,atxA基因的相对表达量与芽胞形成率呈负相关,虽然单独导入plcR和FplcRpapR均不影响芽胞的形成,但影响A16R的芽胞形成率,在重组菌株pBE2A-plcR/A16R与pBE2A-IFplcRpapR/A16R中其芽胞形成率均降低。
[Abstract]:PlcR is a very important regulatory factor in Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis. The expression of a variety of virulence factor encoding genes are activated by it, such as phospholipase, protease, and hemolysin. The expression of hemolysin and cytotoxin in Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis can be expressed by changing the sequence of plcR gene. The comparative genomics showed that the plcR gene sequence in Bacillus anthracis was homologous with Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis, but the plcR gene had a nonsense mutation in Bacillus anthracis, causing PlcR to not normally express in Bacillus anthracis. In order to study the anthrax bud of the plcR gene In this study, ten strains of Bacillus cereus CMCC63301 genome were used to construct pBE2A/A16R, pBE2A-FplcRpapR/A16R, pBE2A-papR/A16R, pBE2A/B17DD, pBE2A-plcR/B17DD, pBE2A-plcRpapR/B17DD, pBE2A-papR/B17DD, pBE2A-FplcRpapR/B17DD, for phenotype analysis, and pBE2A/A16R, pB. E2A-plcR/A16R, pBE2A-FplcRpapR/A16R, pBE2A-plcRpapR/A16R, pBE2A-papR/A16R were studied in proteomics, and the three genes of atxA, SPH, PLC in pBE2A/A16R, pBE2A-plcR/A16R and pBE2A-FlcRpapR/Al6R were studied at the transcriptional level. The results showed that the sequence of papR and plcRpapR whole genes was introduced into the anthrax bud separately. The hemolytic activity and lecithin activity of the recombinant strain pBE2A-plcRpapR/A16R, pBE2A-papR/A16R, pBE2A-plcRpapR/B17DD, and pBE2A-papR/B17DD did not recover as the recombinant strain pBE2A/A16R, pBE2A/B17DD, and the recombinant strain pBE2A-plcR/A16R, the hemolytic activity of pBE2A-plcR/B17DD was not restored, and some of the phosphatidylase activity was restored. The lysozyme activity and the lecithin activity of the recombinant strain of pBE2A-FplcRpapR/A16R and pBE2A-FplcRpapR/B17DD all recovered. It showed that the activity of some lecithin could be activated directly after the introduction of the plcR single gene of Bacillus cereus into Bacillus anthracis, but it could not activate the activity of the lysozyme; the fusion gene FplcRpapR was introduced into the anthrax. After bacillus, the activity of lysozyme and lecithin was recovered, but the hemolytic activity of the pBE2A-FplcRpapR/A16R recombinant strain was not regulated by pBE2A-FplcRpapR/B17DD stable.PlcR protein, and its more conservative N end, belonging to the DNA binding region, was highly conserved in the promoter region of the plcR regulation gene. NNNNTNC ATA, we speculate that he might constitute the plcR identification site (PlcR-box), according to which we find 92 proteins that may be regulated by PlcR, through the study of pBE2A/A16R, pBE2A-plcR/A16R, pBE2A-FplcRpapR/A16R, pBE2A-plcRpapR/A16R, pBE2A-papR/ A16R proteomics, in the difference protein we find. 4 proteins were regulated by PlcR. At the transcriptional level, atxA and PLC, SPH and other genes related to hemolysin, lecithin, PLC, SPH genes were positively correlated with the hemolytic activity and the activity of lecithin. The relative expression of the atxA gene was negatively correlated with the rate of bud formation, although both plcR and FplcRpapR were introduced alone. However, the spore formation rate of A16R was lower than that of pBE2A-plcR/A16R and pBE2A-IFplcRpapR/A16R.
【学位授予单位】:海南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S852.61
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,本文编号:1863303
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