旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的克隆、表达及特性研究

发布时间：2021-03-26 22:08

丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine Proteinase Inhibitor,SPI)是一类对丝氨酸蛋白酶活性有抑制作用的蛋白质超家族,不但能够通过调节蛋白酶活性影响蛋白质代谢从而参与凝血、补体活化、炎症反应、细胞凋亡、细胞迁移及纤溶等许多生理和病理过程,而且也是生物体免疫系统的重要组成部分,起免疫增强和抑制作用的同时也能引起强烈的免疫应答。随着人蛔虫、马来丝虫、猪蛔虫、钩虫、盘尾丝虫、捻转血矛线虫、旋毛虫、异尖线虫、血吸虫、鞭虫、华枝睾吸虫、肺吸虫和细粒棘球绦虫等寄生虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂不断被分离鉴定,证明SPI是寄生虫与宿主间相互作用的重要分子。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂(Kazal-type Serine Protease Inhibitor,Ka SPI)是较为保守的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族之一,结构上因含有Kazal型结构域而与丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的其他成员相区别,但是在功能上KaSPI与丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的其他成员却具有相似性。目前研究范围较广的Ka SPI多见于水产动物,如中国对虾、克氏原螯虾、扇贝、蟹类等,Ka SPI对于水产动物的抑菌性有重要意义。目前,对旋毛虫Ka SPI(TsKa SPI)的研究还未见到,所以研究Ts Ka SPI不仅可以为进一步深入研究SPI参与虫体与宿主之间相互作用提供理论依据,而且为防治旋毛虫病奠定坚实的基础。本文根据Gen Bank上Ts KaSPI的基因编码序列设计带有酶切位点的特异性引物,提取旋毛虫肌幼虫总RNA,反转录得到c DNA后作为模板进行RT-PCR扩增,然后将所获PCR产物克隆至p EASY-T1载体后转入克隆感受态Tans5α,经过PCR和Eco R I、Xho I双酶切鉴定后进行测序,结果显示克隆的序列由852个核苷酸组成,编码283个氨基酸。利用生物信息学方法对序列进行结构分析,结果显示Ts Ka SPI具有Kazal-FS结构域,不仅具有Kazal型结构域而且具有卵泡抑素结构域,具备Ka SPI的特点。本文利用原核表达载体p ET-30a(+)构建重组表达质粒p ET-Ts Ka SPI,经PCR和双酶切鉴定后转入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用IPTG诱导蛋白表达。SDS-PAGE电泳分析所得融合蛋白主要以包涵体形式存在,融合蛋白的分子量约为38KDa,与预测的理论值相符。包涵体蛋白经过电洗脱进行纯化,然后将纯化蛋白进行透析复性,所获纯化的重组蛋白经Western Blot分析,结果显示该蛋白可以被感染旋毛虫小鼠阳性血清所识别。将纯化的重组蛋白腹腔注射到小鼠体内检测免疫保护性,旋毛虫肌幼虫减虫率为38.3%。间接ELISA法检测血清抗体水平,结果显示重组蛋白免疫小鼠诱导抗体Ig G水平显著高于对照组和佐剂组小鼠。复性的重组蛋白与部分蛋白酶作用,结果显示所获得的复性蛋白可以抑制凝血酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶G、弹性蛋白酶、糜蛋白酶及颗粒酶B的活性,并且重组蛋白浓度越高抑制效果越好。将纯化蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,利用多克隆抗血清进行免疫印迹及免疫组织化学染色试验,免疫印迹结果显示多克隆抗血清作为抗体可以识别重组蛋白并与之结合,说明该重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性;免疫组织化学染色试验结果显示Ts Ka SPI在旋毛虫肌幼虫时期有所表达并分布于虫体表面和内部。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;S852.7

文章目录

摘要

Abstract

1 前言

1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂概况

1.2 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂概况

1.2.1 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构特征

1.2.2 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用机制

1.2.3 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能

1.3 丝氨酸蛋白酶抑制剂在寄生虫中的研究进展

1.3.1 寄生性蠕虫丝氨酸蛋白酶抑制剂

1.3.2 寄生性原虫丝氨酸蛋白酶抑制剂

1.4 研究目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 虫种和实验动物

2.1.2 菌株和载体

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器和设备

2.1.5 主要软件及网络资源

2.2 试验方法

2.2.1 TsKaSPI基因克隆

2.2.2 TsKaSPI重组表达质粒p ET-TsKaSPI的构建

2.2.3 TsKaSPI重组蛋白的诱导表达及表达条件优化

2.2.4 TsKaSPI重组蛋白的纯化及Western Blot印迹

2.2.5 发色底物法检测重组蛋白酶活性

2.2.6 重组蛋白对小鼠的免疫保护性研究

2.2.7 旋毛虫KaSPI蛋白的抗原性检测

3 结果

3.1 基因克隆结果

3.1.1 旋毛形线虫肌幼虫目的基因片段RT-PCR扩增结果

3.1.2 重组克隆质粒DNA的鉴定

3.1.3 信号肽预测结果

3.1.4 NLS和NES预测结果

3.2 诱导表达结果

3.2.1 TsKaSPI重组表达质粒构建结果

3.2.2 TsKaSPI重组蛋白表达时相及可溶性分析

3.2.3 TsKaSPI重组蛋白的表达IPTG浓度的优化

3.2.4 TsKaSPI重组蛋白的表达温度的优化

3.2.5 TsKaSPI重组蛋白的纯化结果

3.3 TsKaSPI重组蛋白的免疫印迹分析

3.4 发色底物法检测重组蛋白酶活性

3.5 旋毛虫KaSPI蛋白的抗原性检测

3.5.1 TsKaSPI重组蛋白对小鼠的免疫保护性研究结果

3.5.2 多克隆抗体Western Blot分析

3.5.3 免疫组织化学染色分析

4 讨论

4.1 TsKaSPI的克隆

4.2 TsKaSPI原核表达体系的构建

4.3 TsKaSPI活性检测

4.4 TsKaSPI免疫相关性

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

【参考文献】