RNA干扰和基因打靶技术阻断山羊体细胞MSTN基因表达的研究

发布时间：2018-05-19 20:43

本文选题：肌肉生长抑制素 + RNA干扰　；参考：《南京农业大学》2015年博士论文

【摘要】：肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN),是转化生长因子β(TGF-β)超家族中的一员,又称为生长分化因子-8(GDF-8)。MSTN基因敲除的超级鼠和双肌牛的研究证明该基因是骨骼肌生长发育的负调控因子。RNA干扰(RNAi)是近些年发现的广泛存在于自然界中的由dsRNA介导的一种序列特异性的转录后基因沉默(PTGS)现象。目前该技术已经成为一种新的研究特定基因功能及其表达调控的工具。基因打靶(Gene targeting)是一种对生物遗传信息进行定向改造的技术手段,传统的基因打靶技术是指利用外源DNA与细胞基因组DNA同源序列发生同源重组,将胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESC)或胎儿成纤维细胞作为介导,以研究靶基因功能及其在相关疾病发生机制中的作用为目的,从而人为地对细胞基因组进行位点特异性修饰的实验技术。本研究选取山羊MSTN基因作为研究对象,分别采用RNAi和基因打靶技术进行阻断MSTN基因表达的研究。首先,针对MSTN cDNA序列设计并构建了4个表达microRNA(miRNA)的干扰载体以及1个过表达MSTN的载体,然后将这4个干扰载体与过表达载体分别共转染293FT细胞以验证miRNA的有效性,并筛选出2个干扰效率最高的miRNA。再将这两个miRNA连接到含有GFP标记的表达载体上,将该载体分别转染山羊胎儿成纤维细胞(GFF)和骨骼肌卫星细胞(SMSC)以进一步验证miRNA的干扰效果,同时还检测了干扰素反应诱发基因IFN-β、OAS2、Mx1、IFI44和STAT1的表达情况。此外,利用基因打靶技术构建了山羊MSTN基因敲除载体并将该载体转染GFF细胞,用药物筛选抗性细胞克隆,经鉴定后获得打靶阳性的细胞克隆,以用于转基因下游体细胞核移植过程。本研究共分为五个部分,主要的研究结果如下:第一部分山羊MSTN基因miRNA干扰载体的构建及其有效性检测。首先,利用在线工具Block-iT RNAi Designer设计了4个针对山羊MSTN mRNA序列的miRNA序列,将其转换成编码pre-miRNA的DNA序列,化学合成两条寡聚单链DNA并退火处理,然后连接到载体pcDNA6.2-GW/miR上,得到miRNA干扰载体pD-miRNA。采用基因合成方法合成MSTN CDS序列并与载体pEGFP-C1连接,得到MSTN过表达载体C1-MSTN,其中GFP和MSTN构成融合基因。将pD-miRNA和C1-MSTN以3:1的质量比共转染293FT细胞,转染24h后,保证所有拍摄条件一致并用荧光显微镜拍照,然后分析细胞照片的荧光强度,荧光强度的平均值代表了靶基因的蛋白表达水平。转染48h后,收集转染的细胞并将其平均分为两部分,其中一半细胞用于qPCR分析,另一半细胞用于western blot分析。通过荧光强度分析、qPCR和western blot三种方法检测MSTN基因的表达量,结果表明,4个miRNA均能显著抑制MSTN表达,其中miRNA-1和miRNA-3的干扰效率最高,对MSTN mRNA和蛋白质的干扰效率分别为38%和48%。这些结果说明设计的miRNA能够特异性沉默山羊MSTN基因,筛选出的miRNA-1和miRNA-3可以用于后续试验沉默内源性MSTN的研究。第二部分GFF细胞内MSTN基因沉默的研究及脱靶效应的检测。采集胎龄60d的山羊胎儿,利用组织块培养法结合胰蛋白酶消化法分离纯化得到GFF细胞,细胞性别鉴定为雌性,绘制的生长曲线显示细胞增殖特性正常,转染效率为80%,符合转基因克隆的基本要求。细胞抗性试验确定杀稻瘟菌素筛选细胞的最佳浓度为10～12μg/mL。将miRNA-1和miRNA-3克隆到载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR上,得到荧光型干扰载体pDG-miRNA,其中GFP作为报告基因能够监控miRNA表达。将pDG-miRNA载体瞬时转染GFF细胞,发现miRNA-1和miRNA-3均能有效抑制MSTN基因的表达,但同时检测到IFN反应诱发基因IFN-β和OAS2的表达量急剧上升。将pDG-miRNA载体稳定转染GFF细胞,发现仅miRNA-1能有效抑制MSTN基因的表达,而IFN-β和OAS2的表达量与瞬时转染相比明显下降。这些结果说明免疫刺激引发的脱靶效应随着导入miRNA的浓度减少而降低,降低miRNA的浓度有利于减少RNAi引起的脱靶效应。第三部分SMSC细胞内MSTN基因沉默的研究及脱靶效应的检测。取山羊胎儿股外侧肌,采用胶原酶和胰蛋白酶联合消化法结合差速贴壁法分离纯化SMSC细胞。由于SMSC细胞在体外培养时容易分化和融合形成肌管结构,所以该细胞原代培养48h后及时地做细胞传代并严格控制细胞密度。通过Desmin蛋白的免疫荧光染色和融合形成肌管的方法,鉴定SMSC细胞具有较高的纯度以及成肌特性。SMSC细胞的转染效率为70%,符合基因沉默试验的基本要求。将pDG-miRNA载体瞬时转染SMSC细胞,发现miRNA-1和miRNA-3均能有效抑制MSTN基因的表达,但也检测到IFN反应诱发基因Mx1、IFI44和STAT1的表达量均显著上升。这些结果说明miRNA-1和miRNA-3在SMSC细胞内触发了免疫应激反应,从而导致脱靶效应的产生。第四部分山羊MSTN基因打靶载体的构建及其正负筛选标记的有效性检测。利用长片段PCR扩增技术从山羊基因组中获得了基因打靶所需的两个同源臂,其中5'同源臂长度为5.2kb,位于5'调控区和内含子2之间;3'同源臂长度为1.1kb,位于外显子3和3'调控区。将两片段分别克隆到pMD19-T载体上,进行测序鉴定,与山羊、牛MSTN基因同源性分别为99.7%、95%,说明扩增片段确实是山羊MSTN基因,完全可以用于基因打靶载体构建。将两个同源臂分别将其克隆到载体ploxPneo上,得到含有正负筛选标记基因Neo和Tk的打靶载体ploxPneo-MSTN,进行PCR、酶切鉴定及相应DNA序列测定,证实MSTN基因打靶载体构建成功。将打靶载体用NotⅠ酶线性化后转染GFF细胞,分别利用G418(600μg/mL),G418(600μg/mL)/GCV(2μM)进行抗性细胞克隆筛选,对细胞克隆数目进行统计分析,证实了Neo和Tk基因的有效性.第五部分山羊GFF细胞的基因打靶与中靶细胞克隆的检测。进行细胞G418毒性试验,药物筛选浓度以7d内细胞全部死亡为标准,确定了G418筛选细胞的最佳浓度为700μg/mL。将线性化的ploxPneo-MSTN通过脂质体转染整合到GFF细胞基因组的MSTN基因座上,利用G418和GCV对细胞克隆进行药物筛选和单克隆分离,经扩大培养后,获得状态良好的抗性细胞克隆247个。对抗性细胞克隆进行PCR和测序鉴定,最终得到1个打靶阳性细胞克隆,经计算,基因打靶的绝对效率是7.1×10~(-9),基因打靶的相对效率是4.1×10~(-3)。
[Abstract]:In this study , we selected goat MSTN gene as the research object to investigate the effect of target gene function and its expression and regulation . The expression of MSTN gene was detected by means of fluorescence intensity analysis , qPCR and western blot . The results showed that both miRNA - 1 and miRNA - 3 could effectively inhibit the expression of MSTN gene . The results showed that miRNA - 1 and miRNA - 3 could effectively inhibit the expression of MSTN gene . Using G418 ( 600 渭g / mL ) , G418 ( 600 渭g / mL ) / G26 ( 2 渭M ) , the selection of cell clones was performed . The results showed that the optimal concentration was 700 渭g / mL .
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;S827

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