抗缪勒氏管激素在猪卵母细胞和颗粒细胞体外发育中的作用及其机制研究

发布时间：2018-05-26 12:38

本文选题：抗缪勒氏管激素 + 卵母细胞成熟　；参考：《安徽农业大学》2015年博士论文

【摘要】：卵泡募集、发育及排卵是影响人和家畜繁殖力的关键因素,是生殖生物学和动物繁殖学的重要研究领域。原始卵泡的生长启动主要受卵巢自身自分泌、旁分泌因子调控,而抗缪勒氏管激素(AMH,anti-müllerian hormone)是目前已知唯一能抑制原始卵泡募集的内分泌因子,被认为是卵泡发育的调控阀。然而,AMH在卵巢中的表达及调控机制还不清楚,极大地限制了AMH在畜牧生产中的广泛应用。本文通过免疫荧光检测、RNA干扰、实时荧光定量PCR、放射免疫测定、流式细胞术和数字芯片表达谱分析等手段,研究了AMH及其受体AMHR2在猪卵巢等组织的表达,探讨了AMH对卵母细胞成熟及胚胎发育、颗粒细胞增殖和凋亡、类固醇产生、膜细胞类固醇产生、基因调控等方面的影响,分析了AMH在猪卵母细胞和颗粒细胞体外发育中的调控作用及其机制。结果如下:试验一:AMH在猪卵巢及其它组织中的表达模式通过荧光定量PCR,发现猪AMH和AMHR2 mRNA均高表达于生殖器官睾丸和卵巢中,在其它组织器官中低表达或不表达。组织免疫荧光检测结果表明,AMH在原始卵泡和初级卵泡颗粒细胞及卵母细胞中不表达,在腔前和有腔卵泡颗粒细胞中表达,高表达于卵丘颗粒细胞。荧光定量PCR结果显示,当卵泡直径从1~3mm增加到3~5mm时颗粒细胞中AMH mRNA表达显著下降(P0.05)。当卵泡直径从3~5mm到5mm时,颗粒细胞中AMHR2 mRNA表达量显著升高(P0.05)。通过ELISA测定结果发现,1~3mm卵泡中AMH浓度显著高于3~5mm和5mm卵泡中AMH浓度(P0.05),在5mm的卵泡中,AMH浓度几乎无法测出。结果提示,AMH在猪卵巢及其它组织中的表达模式和其它物种相似。试验二:AMH对猪卵母细胞体外成熟的影响首先,以非限定性培养基为基础培养基,添加不同浓度AMH,用于培养猪卵丘细胞-卵母细胞复合体(COCs,Cumulus-oocyte-complexes),42±2h后发现,各处理组在卵母细胞成熟率、卵丘扩散指数,孤雌激活后胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数上均无显著差异(P0.05)。其次,以含PG600的化学限定培养基为基础培养液,添加不同浓度AMH并用于COCs体外培养,42±2h后发现,10ng?m L AMH可显著提高卵母细胞成熟率(P0.05),但不影响其卵丘扩散指数和卵母细胞孤雌激活后的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数(P0.05);卵母细胞体外受精后,10ng?m L AMH可以显著提高体外受精胚的卵裂率(P0.05),但对囊胚率和囊胚细胞数没有影响(P0.05);卵母细胞成熟后,荧光定量PCR结果显示,相对于对照组,10 ng?m L和100ng?m L的AMH添加组成熟卵母细胞中GDF9和BMP15 mRNA表达均无显著变化(P0.05),且各组卵丘卵母细胞中CASPASE3和BAX mRNA均无显著差异(P0.05),但10ng?m L和100ng?m L的AMH添加组BCL2 mRNA变动显著高于对照组(P0.05)。结果表明,10 ng?m L AMH可促进卵母细胞核和胞质成熟。试验三:AMH在颗粒细胞中的调控作用体外培养期间,单独添加AMH对颗粒细胞FSHR和CYP19A1 mRNA的表达及雌激素的产生无影响(P0.05),但FSH可以促进FSHR和CYP19A1mRNA的表达和雌激素的产生(P0.05)。FSH和AMH共同添加时,AMH可以显著抑制FSH对FSHR和CYP19A1 mRNA表达和雌激素产生的促进作用。对颗粒细胞进行AMH si RNA干扰后,再以FSH处理培养的颗粒细胞,其FSHR和CYP19A1 mRNA表达和雌激素产生均显著升高(P0.05),但与未干扰AMH且添加FSH组无显著差异(P0.05)。结果说明,AMH具有抑制FSH促进猪颗粒细胞类固醇激素产生和相关基因表达的功能。试验四:AMH对猪卵泡膜细胞类固醇激素产生的影响利用Procoll方法获得高纯度卵泡膜细胞,通过RT-PCR发现卵泡膜细胞中有AMHR2 mRNA表达。LH处理卵泡膜细胞48h,可显著提高卵泡膜细胞中类固醇合成的关键基因3β-HSD、CYP11A1、CYP17A1和LH受体LHCGR mRNA的表达和雄烯二酮、孕酮的产生(P0.05)。AMH处理膜细胞对3β-HSD、CYP11A1、CYP17A1、LHCGR、STAR和CYP17A1 mRNA的表达和雄烯二酮、孕酮的产生均无显著影响(P0.05)。LH和AMH共同处理卵泡膜细胞时,显著抑制LH诱导的3β-HSD、CYP11A1、、CYP17A1和LHCGR mRNA的高表达(P0.05),显著降低雄烯二酮的产生(P0.05)。在AMHR2被si RNA干扰的卵泡膜细胞中,LH添加组与AMH/LH共同添加组中3β-HSD mRNA的表达无显著差异(P0.05),表明AMH降低LH促进3β-HSD mRNA表达的协同作用消失。si AMHR2干扰后,LH显著促进雄烯二酮和孕酮的产生(P0.05),而LH和AMH共同添加时,雄烯二酮的产生显著高于对照组(P0.05),说明AMH对LH的促进的雄烯二酮分泌的抑制作用消失。结果提示,AMH在卵泡膜细胞中具有调控LH诱导类固醇产生的作用。试验五:AMH处理猪体外培养腔前卵泡基因表达谱分析为探索褪黑素影响猪卵泡发生的分子机制,对AMH处理18.5 d的PFsOGCs进行数字芯片表达谱测序,通过差异基因表达分析,共筛选出159个上调基因和7个下调基因。qPCR验证结果与测序结果一致,说明RNA-Seq数据真实可靠。Gene Ontology显著性富集分析结果显示,AMH添加组的差异基因显著性富集于代谢通路、TGFβ家族、ECM-receptor等相关通路。本研究表明,AMH在猪卵巢中的表达模式与其他物种相似。10ng/m L AMH对卵母细胞核成熟和胞质成熟有促进作用,提高卵母细胞成熟效率和体外受精的卵裂率。在猪颗粒细胞中,AMH可以抑制FSH诱导的芳香化酶和雌激素的产生。首次发现通过其受体,AMH可以抑制LH诱导的卵泡膜细胞雄烯二酮的产生,说明AMH在卵泡颗粒细胞和膜细胞均起到抑制类固醇产生的作用。AMH主要通过TGFβ通路、代谢通路和ECM-receptor通路调控基因。
[Abstract]:The expression of AMH and AMHR2 mRNA in the ovary and other tissues of porcine oocytes were studied by means of immunofluorescence assay , RNA interference , real - time fluorescence quantitative PCR , radioimmunoassay , flow cytometry and digital chip expression profiling . The results showed that AMH had no significant difference between the expression of FSHR and CYP19A1 mRNA and the production of estrogen ( P0.05 ) . The results showed that AMH could significantly increase the cleavage rate of FSHR and CYP19A1 mRNA and estrogen production ( P0.05 ) . The results showed that AMH could inhibit the production of testosterone induced by LH . The results showed that AMH could inhibit the production of testosterone and testosterone .
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S828

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