大白猪和清平猪分娩启动过程中miRNA表达分析和miR-144功能研究

发布时间：2018-05-29 06:19

本文选题：猪 + 高通量测序　；参考：《华中农业大学》2017年博士论文

【摘要】：分娩启动是一个非常复杂的生理过程,通过激活炎症反应和一系列生物化学事件而引起激素变化,其机制尚未研究清楚。近年来的研究发现miRNA参与分娩启动时子宫肌层收缩和孕酮(Progestone,P4)代谢。因此,本研究旨在阐明miRNA调控分娩启动的分子机制。我们分别提取妊娠114 d有分娩征兆的大白猪(LL)、妊娠111 d有分娩征兆的清平猪(QS)、妊娠114 d有分娩征兆的清平猪(QL)和妊娠111d没有分娩征兆的大白猪(LN)胎盘组织的总RNA,分别构建两个猪种不同妊娠期胎盘组织的小RNA文库,运用高通量测序技术获得miRNA表达谱。将LL、QS和QL的mi RNA表达谱分别与LN的miRNA表达谱对比,获得差异表达miRNA,预测其潜在靶基因,运用GO功能注释靶基因,从中筛选与分娩启动相关的miRNA。以筛选出的与分娩启动相关的miR-144为研究对象,探究其在分娩启动过程中的作用。本课题主要研究结果如下:1.在清平猪和大白猪的胎盘中,通过Illumina测序获得12组原始序列,原始序列在4,131,656条到5,687,285条之间。每个样本的clean reads占原始序列的60%~93%,建库质量较好。2.通过edgeR软件分析LL、QS和QL与LN的miRNA表达谱,获得三组差异表达miRNA。结果显示与LN胎盘相比,在LL胎盘中发现9个上调和10个下调的miRNA,miR-144在LL中上调表达,并且有研究报道其调控前列腺素(Prostaglandin,PG)的分泌;在QL胎盘中发现13个上调和10个下调的miRNA;在QS胎盘中发现14个上调和7个下调的miRNA。3.预测三组差异表达miRNA潜在靶基因,GO分析靶基因。结果显示其主要富集到与激素刺激响应相关的生物学过程。KEGG分析显示,大多数基因富集到与炎症响应和激素代谢有关的通路。4.运用Cytoscape软件构建LL/LN中miRNA与节点mRNA的调控网络。结果显示,ssc-miR-345-5p和ssc-miR-326靶向HNF4A、Fos和SMAD3基因,ssc-miR-193a-3p、ssc-miR-664-3p和ssc-miR-122靶向SMAD3基因,为分娩启动研究提供新的思路。5.分析妊娠15.5 d和18.5 d小鼠羊膜组织,发现在妊娠18.5 d时miR-144、Fos和COX2(cyclooxygenase 2)的表达显著上调,PGE2的分泌增加。运用脂多糖(LPS)构建小鼠早产模型,分析表明,LPS显著增加miR-144、Fos和COX2基因的表达水平。表明在分娩和早产中miR-144、Fos和COX2基因可能发挥作用。6.利用转录因子Fos超表达载体转染人羊膜上皮(WISH)细胞,分析发现,miR-144、Fos和COX2显著上调表达。通过构建miR-144启动子分段缺失的pGL3荧光载体,发现pGL3-promoter-700荧光活性最高。通过构建转录因子结合突变的荧光载体、EMSA和ChIP分析验证在miR-144启动子区存在3处转录因子Fos的结合位点。7.利用miR-144 mimics分别与Fos 3’UTR和COX2 3’UTR的primGLO载体共转染Hela细胞,证明mi R-144显著抑制prim GLO-Fos 3’UTR和primGLO-COX23’UTR载体的双荧光素酶活性。在WISH细胞中转染miR-144 mimics,表明miR-144显著降低Fos和COX2的表达水平,显著抑制PGE2的分泌。在WISH细胞中共转染miR-144 mimics/COX2靶标保护剂/Fos靶标保护剂,Western blot分析发现COX2蛋白水平高于对照组,表明miR-144可以通过Fos间接靶向COX2。在WISH细胞中,转染Fos过表达/Fos靶标保护剂/COX2靶标保护剂,结果表明,添加COX2保护剂能够显著上调COX2蛋白的表达,上调PGE2的分泌,表明伴随着Fos上调表达,miR-144能部分抑制COX2蛋白的表达。8.怀孕15.5 d的小鼠注射雌激素(Estrogen,E2),模拟分娩。注射E2能够显著上调羊膜中miR-144、Fos和COX2的表达。WISH细胞中添加10 nM E2,结果与小鼠羊膜一致。结论:(1)通过高通量测序分析分娩启动时大白猪和清平猪胎盘组织的小RNA文库,获得大白猪和清平猪分娩启动时mi RNA表达谱,从转录组水平系统地阐述了激素调控、免疫和炎症反应等生物学过程是分娩启动的分子基础。(2)进一步的研究结果表明,在怀孕小鼠羊膜和人羊膜细胞中Fos、COX2和miR-144调节PGE2的分泌。
[Abstract]:In the placenta of Qingping pigs and large white pigs , 9 up - regulated and 10 down - regulated miRNA expression profiles were obtained . The results showed that there were 14 up - regulated and 10 downregulated miRNA in the placenta . In WISH cells , miR - 144 was transfected into human amniotic epithelial ( WISH ) cells . The results showed that miR - 144 inhibited the expression of COX2 protein significantly . The results showed that miR - 144 inhibited the expression of COX2 protein significantly .
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S828

【参考文献】