新型鸭细小病毒DS15株的分离鉴定及VP2蛋白在昆虫细胞中的表达

发布时间：2018-06-18 17:18

  本文选题：鸭短喙侏儒综合征 + 新型鸭细小病毒　； 参考：《甘肃农业大学》2017年硕士论文

【摘要】：2014年以来,中国东部许多肉鸭养殖场发生了一种新的鸭病毒性传染病,临床上主要表现为雏鸭生长发育迟缓,上下喙萎缩,鸭舌头肿大外伸,行走困难。暂命名为鸭短喙侏儒综合症(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)。该病病死率很低,但发病率10%~30%,部分鸭群发病率达到50%。给养鸭业造成较为严重的经济损失。由于这是一种在我国新出现的鸭传染病,其致病病原尚不清楚,更缺乏有效的疫苗或治疗性药物。为此,本研究对采自安徽省砀山县某养殖场发病鸭的病料进行了病原分离和鉴定,同时还对其全基因组序列进行了克隆和测序,此外我们还利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中尝试表达了病原的结构蛋白,为进一步研制新型疫苗或药物奠定基础。首先,对砀山发病鸭实质脏器进行了RT-PCR/PCR检测,在排除其他常见鸭病毒性传染病病原的前提下,初步确定该病病原为新型鸭细小病毒(Novel duck parvovirus,NDPV)。然后,将组织研磨液接种SPF鸭胚,盲传3代后鸭胚出现规律性死亡。在鸭胚尿囊液中检测到了新型鸭细小病毒,其病毒滴度(ELD50)为10-4.2/0.2mL。将感染鸭胚的尿囊液进行浓缩和纯化,在扫描电镜下可见直径20nm左右,正二十面体病毒粒子。用病毒液感染1日龄雏鸭,可复制出与临床症状相似的鸭短喙侏儒症状,进一步证实分离的鸭细小病毒是造成鸭短喙侏儒综合症的关键性病原。参照Genbank登录的鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)B株的基因序列,我们设计了6对特异性引物,对NDPV DS15株的全基因序列进行了分段扩增。试验结果显示,NDPV DS15株病毒基因组全长5104nt,结构与鹅细小病毒相似,两端为ITR,中间为两个大开放阅读框。与其他水禽细小病毒进行全基因组同源性比对,分析结果显示DS15株与鸭短喙侏儒症分离株GPV SDLC01同源性最高,达到99.8%,与其他GPV同源性在92.6%~97.2%之间,与番鸭细小病毒(Muscovy parvovirus,MDPV)同源性在81.2%~85.4%之间。DS15株NS1蛋白和VP1蛋白的氨基酸序列分析结果显示,与传统的GPV相比,我们分离到的NDPV DS15株和其他几株鸭短喙侏儒症分离株在NS1和VP1蛋白氨基酸水平具有极高相似性,氨基酸突变情况基本相同。系统发育进化树显示,水禽细小病毒分为GPV和MDPV两大分支,DS15株与其他几个SBDS分离株处于GPV分支且单独形成一个小分支。为了制备检测NDPV的多克隆抗体,本文用PCR法扩增NDPV的VP3基因,克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21菌株,以IPTG诱导表达重组VP3蛋白,然后利用包涵体纯化方法纯化重组VP3蛋白,免疫试验兔获得多克隆抗体。Western-blot检测结果表明,该抗体能与重组的NDPV VP3蛋白及自然感染的NDPV发生反应,证明制备的抗体具有良好的抗原反应性。为给研发抗NDPV感染的亚单位疫苗提供候选抗原,我们用PCR方法扩增了DS15株VP2基因,然后将其插入供体质粒pFastBacHTA中,构建重组pFastBacHTA-VP2供体质粒。再转化DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选获得重组穿梭质粒Bacmid-HTA-VP2。用该重组质粒转染sf9细胞,48h后分别用间接免疫荧光和Western blot试验检测靶基因的表达。结果表明我们在sf9细胞中成功表达出VP2蛋白,电镜负染结果进一步证明,所表达的重组VP2蛋白能够在昆虫细胞中自我组装形成病毒样颗粒。动物实验结果表明所制备的病毒样颗粒具有良好免疫原性。这些研究结果为进一步研制NDPV诊断抗原和病毒样颗粒疫苗奠定了基础。
[Abstract]:Since 2014 , there has been a new duck viral infectious disease in many duck farms in eastern China , which is mainly characterized by slow growth and development of ducklings , atrophy of upper and lower beaks , enlargement of the tongue of the duck tongue , and difficulty in walking . The morbidity of the disease is very low , but the incidence rate is 10 % 锝，

本文编号：2036268