DNA条形码技术及在兽医寄生虫研究中的应用

发布时间：2015-06-25 11:12

2、DNA条形码基因的筛选
    DNA条形码的主要难题在于寻找理想的条形码基因，来区分动物种群。能够用作条形码的基因，必须具备两个看似矛盾的特征： (1)具有相对的保守性，便于通用引物扩增；(2)要有足够的变异能够将物种进行区分。
    对不同动物类群的研究结果显示，超过95%的物种其线粒体细胞色素C氧化酶亚单位I
(COⅠ)特定区段的基因序列拥有特异性，该序列可用于动物物种水平的鉴定^[9]。因为：动物生命中绝大部分阶段都有明显的COⅠ基因序列，大多数细胞中虽有上百个线粒体，但只有一组染色体，因此等量的样品中，线粒体DNA更容易被放大和使用；COⅠ在能够保证足够变异的同时又很容易被通用引物扩增，而且目前研究表明，其DNA序列本身很少存在插入和缺失；与细胞核DNA相比，线粒体DNA的突变速度是核DNA的10倍，即核DNA的变异容易被保留而线粒体的变异丢失很快，这样使物种分离更准确；线粒体的遗传方式属于母性遗传，COⅠ基因位于细胞线粒体中，基因重组的发生率相对较低；它还拥有蛋白编码基因所共有的特征，即密码子第三位碱基不受自然选择压力的影响，可以自由变异^[10]。Hebert等对包括脊椎动物和无脊椎动物共11门13320个物种的COⅠ基因序列的比较分析得出：除腔肠动物外，98%的物种遗传距离的差异在种内为0% ~2%，种间平均可达到11. 3%。据此，Hebert提出可以用COⅠ基因来代表物种，作为物种条形码为全球生物进行编码^[2]。
但是，仅仅考虑COⅠ单基因并不能解决所有问题，由于存在一些影响因素：如近缘种的进化率、遗传差异、线粒体DNA的基因渗入现象以及COI序列比对时内含子的突变等，使得运用单个COⅠ基因比对时常常缺少准确性^[11]。已发现的其它分子标记，包括核糖体RNA（rRNA）亚基基因被认为是很有前景的候选因子，它们在基因组上的大量冗余，以及在侧翼区的相对保守性，使得rRNA的使用大大提高了物种鉴别的效率 ^[12]。另外，转录间隔区（ITS）序列在最近几年，也被越来越多地用于物种的分类鉴定。所以，通过发展一种多基因系统的DNA条形码，来进行物种鉴定是不可避免的趋势^[13，14]。
3、DNA条形码的优势
    与传统形态分类方法相比，DNA条形码的优势概括起来有：(1) 鉴定速度快 。DNA条形码的一个明显优势就是能够快速的获得分子数据。与此相比，形态学方面的数据收集则要耗时得多，而且数据容易混淆，有时甚至无法收集。(2) 准确性高。特定的物种具有特定的DNA序列，而形态学鉴别特征会因趋同和变异导致物种的鉴定误差。(3)对于分类学中难以区分的类群，采用DNA条形码可以抛开形态相似的假象，从基因水平上提供一种分类依据。(4)由核苷酸序列组成的数字化数据库，提供明确的信息，不仅弥补了形态描述的不足，而且可以加快已知物种的识别速度，同时便于新物种的发现。(5) 不受个体形态特征限制。采用一小块或一小片材料即可识别一个物种，即使样本受损也不会影响识别结果。 (6)以DNA序列为检测对象，其在个体发育过程中不会改变。同种生物不同生长时期的DNA序列信息是相同的，即使经过加工，形态发生变化，而DNA序列信息不会改变，较之传统的方法，扩大了检测样本的范围。(7)可进行非专家物种鉴定。该技术是可机械重复的，只要设计一套简单的实验方案，经过简单培训即可操作。(9)通过建立DNA条形码数据库，可一次性快速鉴定大量样本。（10）发展潜力大。分类学家新的研究成果将不断地加入数据库，成为永久性资料，从而推动分类学科更加快速深入地发展^[15]。
4、DNA条形码的缺陷
虽然DNA条形码技术显现了巨大的优势，但也突显出一些缺陷。不过这些缺陷随着DNA条形码技术的发展相信会逐渐得以弥补。
4.1. “条形码缺口”的出现
样品的损坏有时导致出现 “条形码缺口”^[18]，这就要求在构建数据库过程中必须注意样品的质量^[19]。在数据库中选择代表分类单元的标本时，该标本必须覆盖已有样品的大部分多样性。
4.2  由线粒体遗传带来的内在影响
线粒体DNA的多样性与导致母性遗传的雌性基因结构之间有很强的相关性。因此，线粒体基因的使用会导致样品的趋异高估或者物种的模糊定位 ^[20]。在种内的线粒体遗传也可因共生体感染而混乱：首先，内共生体的连锁不平衡引发了线粒体DNA上的间接选择^[21]。其次，种间杂交和内共生体感染能使线粒体基因转移而产生个体进化型^[22]。例如在双翅目的果蝇属之间观察到线粒体基因杂交现象就是由沃尔巴克体垂直传播造成的^[23]。在海绵动物和它们的共栖物真菌中观察到由线粒体基因发生水平转移而造成的不同界之间的杂交^[24]。
4.3核线粒体DNA的影响
核线粒体DNA(NUMT)是已经被转录到核基因组上的线粒体DNA序列^[25]。在真核生物中，NUMT的数量和大小是可变的，在疟蚊属、新杆状线虫和疟原虫中很少甚至没有，而在人类、鼠类中其拷贝数都超过了500^[26]。Lorenz等报道^[27]，在研究灵长类的DNA条形码时，由于它们的密码子结构，非同义突变，提前终止编码以及插入缺失等因素^[28]。使得NUMT拷贝有时很大程度上扰乱线粒体COI序列的收集。因此在DNA条形码数据库构建过程中和标本的深入鉴定时必须严格考虑NUMT因素。
5、DNA条形码的分析方法
5.1 单一序列的分析
     DNA条形码分析的主要目标是将目的序列匹配给一组从条形码数据库中提取出来的具有标签的参考序列。条形码数据库使用的方法称为相似性方法，与构建进化树的方法相似，包括以下步骤：第一，通过参考数据库的线性搜索，将目的序列与一段条形码序列进行总体比对^[29]。第二, 将目的序列与预前设置的序列加到一起构建各种进化树，来评估目的序列与参考序列之间的关系，用与目的序列最近的序列的物种来给目的序列命名。这种方法直接、快速。但也存在一些缺点：其准确性高度依赖样品的质量，造成的假阳性比较高^[30]。
5.2  多序列分析
DNA条形码分析的第二个目标是对成簇的个体进行界定。主要有以下三种方法：（1）Hebert等 ^[34]首先提出采用一个变异阈值来界定物种，该理论强调种间变异高于种内变异。最初标准变异阈值设定为：种间变异平均值高于种内变异平均值10倍（即10-倍规则）。尽管该方法已在鱼类、北美鸟类、热带鳞翅类昆虫以及穴居蜘蛛中得到应用，但由于缺少大量的生物支持，变异阈值方法还是不能作为一个普遍的标准适合物种分类。（2）Pons 等 ^[35]使用混合模型发展起来第二种描述物种的方法。他们的方法是以物种和种群在水平方向上分布程度的差异为基础，允许推断分支变迁的时期。尽管该方法在有些地方过于简单化，但将群体遗传和物种形成过程结合到一起，仍不失为是物种分类过程中的经典方法。(3)Barcoding gap检验方法。理想条形码检测到的种间差异应明显大于种内差异，并在两者之间存在一个明显的间隔区，该区域被称作Barcoding gap^[36]。Barcoding gap是评价DNA条形码理想与否的一个重要指标，因此现阶段评价DNA条形码各片段时通常会进行Barcoding gap检验。该检验是用图形来呈现种间、种内遗传距离的分布频度，采用Meier等开发的TaxonDNA软件，并结合一般的统计软件来完成。
总之，在使用DNA条形码得出结论时，都需要其它的序列进行验证，并且应将几种方法的结果进行综合评价。
6、DNA条形码在兽医寄生虫的应用
寄生虫的分类与寄生虫的种类鉴别、历史与进化、诊断、防治等密切相关，是寄生虫学的基础。随着科学的不断发展，传统的分类方法已经不能满足对虫种的鉴定，也不能达到对诸多的寄生虫进行科学的分类。近年来，分子生物学技术迅速发展为寄生虫分类学研究提供了许多新的思路和方法，但诸多学者还在不断的探索新方法来评价和进行寄生虫分类。
 自2003年Hebert提出DNA条形码之后，该技术在兽医寄生虫的分类鉴定中也得到了广泛应用。Adams等^[37]分别以ITS-1，18S和28S作为条形码，在坦桑尼亚境内对采采蝇传播的锥虫作了大规模的调查、鉴定，结果发现了两个锥虫新种，同时也掌握了锥虫在该地区的流行趋势。Stothard^[38]等用血吸虫COI基因相互有重复的两段序列分别作为条形码对收集于乌干达境内艾伯特湖和维多利亚湖的曼氏血吸虫进行验证。结果显示维多利亚湖收集的血吸虫存在很高的核苷酸变异，与此同时艾伯特湖血吸虫的种群则以多种类混合的形式存在，而这些差异是形态学研究无法达到的。孙家梅等^[39]利用COI作为分类条形码，选取我国广泛分布的白岭40个种作为分类单元进行了聚类分析，聚类分析结果与传统分类中的属级分类及白岭属的亚属级分类情况完全吻合，显示出分类稳定性较强，COI序列的遗传距离和分子系统树分析结果显示DNA条形码能够很好的对白岭进行物种识别。马英^[40]对青海省海东地区小型兽类和寄生蚤属总计2纲4目10科31属35种148个样本进行COI的部分序列进行了测定, 显示同一物种的不同个体均形成高支持率的单系，种间分支很明显，说明啮齿动物线粒体COI基因是一个有效的DNA条形码标准基因。另外，还有学者试图将DNA条形码与其它技术进行结合，赵明等^[41]以蚊科5属15种，共30个样本为研究材料，获取其DNA条形码信息(COⅠ基因片段序列)，搜索15个样本的同源保守基因共78条序列，制作虚拟DNA条形码芯片。虚拟电子杂交30个样本，并计算属、种及种内个体间的同一性，以最大简约法分别对杂交结果和原序列进行聚类分析比较。结果属、种及种内个体间的同一性分别为：0.75、0.84、0.98，聚类分析结果一致，说明利用DNA条形码信息设计DNA芯片在理论上是可行的。
 诸如以上，DNA条形码技术在兽医寄生虫中的应用已不仅仅局限于虫种的分类鉴定，它已渗透到寄生虫学的各个方面。随着DNA条形码技术与其他技术的不断结合，新一代的产品将会大量出现。届时，寄生虫学研究也会迎来长足发展。
 7、结语
历时8年发展，DNA条形码方法已少有争论，大量的实验结果以及日益增加的DNA条形码已是很好的证明。然而，对于它自身存在的一些缺陷会逐渐得以弥补。随着对所有的真核生物进行分类，生命工程条形码工程也将逐渐成为更灵活的框架体制。条形码以分类学知识为基础，促进了不同学科之间的相互联系，将产生重大的科学影响和深远的社会意义及经济意义。
 
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作者简介：苟惠天（1980—），男，甘肃临洮人，博士生，E-mail:huitian.0820@163.com。 *通讯作者，研究员，从事虫媒病分子生物学及分子免疫学研究，E-mail:ljxbn@163.com

中图分类号：S852.7

本文编号：20727