猪链球菌2型环二腺苷酸（c-di-AMP）代谢相关基因的生物学功能研究

发布时间：2018-06-29 10:04

  本文选题：猪链球菌2型 + 环二腺苷酸　； 参考：《上海交通大学》2015年博士论文

【摘要】：环二腺苷酸(cyclic diadenosine monophosphate,c-di-AMP)是一种新发现的细菌第二信使分子,其在细菌内的代谢受二腺苷酸环化酶(diadenylate cyclase,DAC)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)的调控。c-di-AMP参与调节多种生理功能,包括细菌的生长、细胞壁的代谢平衡以及细菌的致病力等。猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是一种重要的猪源病原菌,根据其荚膜抗原的不同,猪链球菌分为33个血清型(1~31、33以及1/2型),其中猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)被公认为是毒力最强、临床分离率最高的一种人畜共患病原菌,可致关节炎、心内膜炎、脑膜炎、肺炎和败血症等。虽然SS2存在众多毒力相关因子,但作为一种重要的细菌第二信使分子,c-di-AMP及其代谢基因在SS2中的存在情况及其可能发挥的生物功能尚不清楚。本研究以SS2高致病性菌株HA9801作为研究对象,首次对c-di-AMP及其代谢相关基因及其对SS2的生物学特性和致病力的影响进行了研究。为了确认SS2中是否存在第二信使分子c-di-AMP,采用高效液相色谱(HPLC)法对SS2 HA9801细胞内容物进行了分析,发现在与c-di-AMP标准品相同滞留时间处出现一个疑似峰,分离该物质并经电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析,确认其为c-di-AMP,表明SS2 HA9801能够合成c-di-AMP。进一步定量研究发现,随着SS2的生长,c-di-AMP在细菌细胞内的含量略有升高,至对数生长中期后维持在一个较稳定的水平。参考GenBank上公布的SS2菌株98HAH33的基因组序列(NC_009443.1),基于生物信息学分析,发现SS2中存在可能与c-di-AMP代谢相关的二腺苷酸环化酶基因(dacA)和水解酶基因(gdpP)。以SS2 HA9801菌株基因组为模板,克隆并分析了预测基因,结果发现dacA基因编码一个283 aa的蛋白质,含3个跨膜区和一个具有环化酶活性的DisA_N结构域。gdpP基因编码一个654 aa的蛋白质,含有两个在GdpP同源蛋白中保守的跨膜结构域:PAS结构域和对水解c-di-amp发挥关键作用的dhh/dhha1结构域。两个蛋白的氨基酸序列与其它革兰氏阳性菌中的daca和gdpp蛋白具有较高的同源性。此外,共转录分析结果显示daca和gdpp分别与其下游基因处于同一转录单位。为了揭示预测基因的功能,表达并纯化了daca蛋白和gdpp蛋白。经hplc和esi-ms分析显示,重组蛋白daca99-283在体外可以催化atp生成c-di-amp,其活性依赖于二价阳离子的存在,在mg2+存在的情况下活性较强。重组蛋白gdpp可在体外水解c-di-amp生成papa,而mn2+是其发挥作用的最适金属阳离子。碱性环境较酸性环境更适合两个蛋白的酶活性发挥。通过定点突变和分段表达等研究发现,rhr和dga基序是daca的活性相关位点,其中rhr是atp结合位点;dhh/dhha1是gdpp发挥水解c-di-amp活性的结构域。为了进一步研究c-di-amp及其代谢基因在ss2中发挥的生物学作用,基于同源重组技术,构建了daca以及gdpp基因的缺失突变株。为了不影响各自下游基因的转录,采用了只破坏阅读框的不完全敲除(in-frame)技术。经组合pcr等方法的确认,最终获得了gdppin-frame缺失突变株,但是未能获得daca缺失突变株,究其原因,可能由于daca是ss2生长所必须的基因。此外,经pcr扩增获得包含上游启动子的gdpp基因,并克隆至穿梭质粒pset2s。将重组质粒电转化至gdpp缺失突变株,通过rt-pcr鉴定,获得了gdpp功能代偿互补株。为了揭示gdpp的生物学功能,分析了gdpp缺失对ss2表型和毒力的影响,结果显示,gdpp的缺失导致ss2细胞内c-di-amp含量升高约2倍,表明gdpp参与ss2细胞内c-di-amp的代谢平衡。在相同培养条件下观察野生株和gdpp缺失突变株的表型差异,结果显示,光镜下缺失株细菌聚集成簇,与野生株有明显差异;扫描电镜与透射电镜观察发现缺失突变株细胞形态发生改变,部分菌体有胀大现象。体外实验显示,与野生株相比,gdpp基因缺失株生长速率缓慢,对数期滞后;生物被膜的形成能力增高1.86倍;培养上清的溶血活性降低;对hep-2细胞的黏附和侵入能力也分别下降了36.8%和57.0%。小鼠攻击试验结果显示,gdpp基因缺失株的半数致死量为7.23×108cfu,高于野生株的3.00×107cfu,且小鼠感染缺失株后的存活率高于野生株;gdpp基因的缺失还使ss2ha9801在小鼠特定组织的定殖能力由5.0logcfu/g下降至3.9logcfu/g。此外,感染缺失株的小鼠,其脑、肺和脾脏组织的病理切片均显示正常,而感染野生株的小鼠各组织脏器均发生严重的病理损伤。上述结果表明gdpP以及c-diAMP的代谢水平对SS2的生物学特性和致病力发挥着重要的调节作用。为了揭示gdpP的缺失引起SS2诸多表型变化的原因,基于RNA-seq和荧光定量PCR技术,从转录水平比较了野生株和gdpP缺失株的基因表达差异。结果显示,与野生株相比,gdpP缺失株共有214个基因的转录水平发生两倍以上变化,其中105个基因的转录水平上调,109个基因的转录水平下调。发生变化的基因涉及物质代谢和转运、蛋白质合成与修饰以及毒力等几大类,表明在SS2中c-di-AMP是一类参与全局调控功能的第二信使分子。为了进一步阐明c-di-AMP在SS2中发挥作用的具体机制,挖掘SS2中c-diAMP的结合蛋白非常关键。分别以枯草芽孢杆菌中具有c-di-AMP结合活性的cdi-AMP合成蛋白DisA和牛血清蛋白(BSA)作为阳性和阴性对照,建立了基于2'-AHC-c-di-AMP-agarose的分离c-di-AMP结合蛋白的方法,并采用该方法初步筛选了SS2 HA9801超声破碎菌体中可与c-di-AMP结合的蛋白。经SDS-PAGE检测,共分离出11个清晰的蛋白带,将蛋白酶解后,采用液相色谱与质谱联用(LC-MS/MS)技术分析序列,并经NCBI Mascot database检索,完成了相应蛋白的功能注释,为深入研究c-di-AMP在SS2中发挥作用的具体机制奠定了基础。综上所述,本论文首次发现SS2存在c-di-AMP代谢相关基因,可调控c-diAMP的合成与分解。其中c-di-AMP分解蛋白基因gdpP的缺失对猪链球菌2型的多种生物表型、毒力以及代谢相关基因组转录具有显著影响,提示c-di-AMP在SS2致病过程中发挥着全局性的调控作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.611

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本文编号：2081761