猪圆环病毒2型交叉引物恒温扩增检测方法的建立

发布时间：2018-06-30 01:32

  本文选题：猪圆环病毒型 + 交叉引物　； 参考：《畜牧兽医学报》2016年09期

【摘要】：拟建立一种简便、快速、准确的现场快速分子检测方法,为猪圆环病毒2型(PCV2)疾病的生物安全防控提供技术支撑。采用交叉引物恒温扩增技术原理,根据PCV2 Cap基因设计一组交叉扩增引物,用构建的Cap基因重组质粒作为标准DNA模板,对反应体系的引物浓度、Betaine、MgSO4、dNTP、Bst酶、反应温度和时间进行优化,并结合核酸试纸条技术,建立可视化检测PCV2的交叉引物恒温扩增检测方法(PCV2-CPA)。用建立的CPA检测方法、常规PCR和ELISA方法检测经IFA方法标定的127份临床样品,比较这些方法的敏感性、特异性和符合率。结果显示,最佳反应体系为引物F3、B3各0.5μmol·L-1,CPR 1μmol·L-1,DF5F0.7μmol·L-1、DF5B0.9μmol·L-1,Betaine 0.075mol·L-1,MgSO43mol·L-1,dNTPs 0.4mmol·L-1,Bst DNA聚合酶9.6U。建立的检测方法58℃扩增50min,检测限可达7.6拷贝·μL-1,灵敏度是常规PCR的10倍;与PCV1、PRV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV和RV无交叉反应。三种检测方法的敏感性分别为78.08%~94.52%,特异性为87.03%~92.59%,符合率为84.25%~91.34%,ROC曲线图显示三种检测方法中,CPA检测方法效能最优。建立的猪圆环病毒2型交叉引物恒温扩增检测方法不需要PCR仪,仅一台水浴锅或金属浴即可完成病毒DNA的扩增,密闭的核酸检测试纸条使结果判定直观、客观,且可有效避免气溶胶污染,可应用于猪圆环病毒2型的现场快速检测。
[Abstract]:To establish a simple, rapid and accurate in situ rapid molecular detection method for the prevention and control of porcine circovirus type 2 (PCV2) disease. A set of cross amplified primers was designed according to PCV2 Cap gene by using the principle of cross primer constant temperature amplification. The recombinant plasmid Cap was used as standard DNA template to optimize the reaction temperature and time of the reaction system. Combined with nucleic acid test strip technique, a cross-primer isothermal amplification method (PCV2-CPA) for visual detection of PCV2 was established. The sensitivity, specificity and coincidence rate of these methods were compared with the established CPA assay, routine PCR and Elisa methods for the detection of 127 clinical samples calibrated by IFA method. The results showed that the best reaction system was: primer F3OB3 0.5 渭 mol L-1CPR1 渭 mol L-1F0.7 渭 mol L-1 DF5B0.9 渭 mol L-1n betaine 0.075mol L-1MgSO43mol L-1dNTPs 0.4mmol L-1Bst polymerase 9.6U. The method was amplified at 58 鈩，

本文编号：2084263