基于microRNA表达谱的伪狂犬病毒及其基因缺失株与PK-15细胞互作的研究

发布时间：2018-08-31 16:52

【摘要】：伪狂犬病毒(PRV)属于a疱疹病毒,严重危害猪,每年给养殖业带来重大的经济损失。gE是PRV的重要毒力基因,与gI形成的功能复合体对病毒在细胞间扩散和对神经系统的侵染有重要作用。目前gE基因缺失疫苗被广泛用于PRV的防控,结合抗体检测,作为标记基因的gE基因也可以用来区分疫苗接种猪和野毒感染猪。MicroRNA(简写miRNA)是长度约20-24nt的单链小RNA分子,调控基因的转录后表达水平。大量研究证明,病毒和宿主都可以利用miRNA调节自身与对方的转录物,来实现免疫逃避和自我保护。病毒侵染可导致宿主miRNA表达谱发生变化,可以为其生存创造有利条件,同时宿主也可以利用miRNA来实现免疫清除。本研究将PRV及PRV-gEgl分别接种猪肾传代细胞系(PK-15),24h后分别提取总的RNA,通过solexa测序技术并结合生物信息学方法,对两株病毒侵染PK-15细胞前后的miRNA表达谱进行深入的分析。高通量测序结果显示,在PRV感染后与PRV-gEgl感染后以及未感染的PK-15细胞中分别检测了miRBase19.0数据库猪源成熟miRNA中的218个、221个、225个。除已知的miRNA外,3个样本还分别鉴定出大量新的猪源miRNA以及5个新的病毒miRNA。通过qRT-PCR验证随机筛选出的12个miRNA,发现与高通量测序结果变化趋势相一致,表明测序结果真实可信,可用于后续差异分析。与未感染的PK-15细胞相比较,PRV感染与PRV-gEgl感染后的PK-15细胞中均鉴定出差异显著的miRNA,分别为137个和135个,从中各自筛选出9个差异突出的miRNA并整合TargetScan和miRanda两个数据库的算法,预测它们的靶基因,构建miRNA-target调控网络图。其中下调的ssc-miR-24-3p调控的靶基因最多,ssc-miR-30a-5p与ssc-miR-30d在PRV感染组调控网络中处于核心位置,ssc-miR-10a-5p与ssc-miR-10b在PRV-gEgl感染组调控网络中处于核心位置,影响这整个网络的稳定性。PRV-gEgl感染组相对于PRV感染组有85个(60个上调,25个下调)差异显著的miRNA,表明基因缺失对细胞miRNA的表达有不同影响。为了了解病毒侵染后细胞异常表达的miRNA对病毒的作用,本研究随机选取了ssc-miR-34a、ssc-miR-19、ssc-miR-145-5p和ssc-miR-499-5p,将它们分别转染细胞后接毒,在12和36h时分别收毒。通过荧光定量检测结果显示ssc-miR-34a、ssc-miR-16对PRV复制有抑制作用。本研究鉴定了PRV感染与PRV-gEgl感染PK-15细胞前后的miRNA表达谱,并通过对它们进行比对分析,加深病原宿主互作机制的理解,也对gEgl对细胞的作用有了新的认识。基于miRNA的病原宿主互作机制的深入分析为从miRNA角度防控PRV奠定一些基础,也可以为其作为疫苗、载体或者是神经传导示踪等方面的应用提供理论参考。
[Abstract]:Pseudorabies virus (PRV) belongs to herpesvirus a, which seriously harms pigs. It brings great economic loss to breeding industry every year. GE is an important virulence gene of PRV. The functional complexes formed with gI play an important role in the spread of the virus between cells and the nervous system. At present, gE gene deletion vaccine is widely used in the prevention and control of PRV. Combined with antibody detection, the marker gene gE gene can also be used to distinguish vaccine-inoculated pigs from wild virus infected pigs. MicroRNA (miRNA) is a single strand small RNA molecule with a length of about 20-24nt. The post-transcriptional expression of genes is regulated. A large number of studies have proved that both virus and host can use miRNA to regulate their own and the other side of the transcription to achieve immune evasion and self protection. The miRNA expression profile of the host can be changed by virus infection, which can create favorable conditions for its survival. At the same time, the host can also use miRNA to achieve immune clearance. In this study, PRV and PRV-gEgl were inoculated into porcine kidney passage cell line (PK-15) 24 hours later, the total RNA, was extracted respectively by solexa sequencing and bioinformatics, and the miRNA expression profiles of PK-15 cells before and after the two viruses were infected were analyzed. The high-throughput sequencing results showed that 218, 221 and 225 of mature miRNA from pig origin in miRBase19.0 database were detected in PK-15 cells after PRV infection and PRV-gEgl infection, as well as in uninfected PK-15 cells. In addition to known miRNA, a large number of new porcine miRNA and five new virus miRNA. were identified in the three samples. The results of 12 miRNA, screened by qRT-PCR were consistent with the trend of high throughput sequencing, which indicated that the sequencing results were reliable and could be used for subsequent differential analysis. Compared with the uninfected PK-15 cells, 137 and 135 PK-15 cells with significant difference were identified in the PK-15 cells infected with PK-15 and PRV-gEgl, respectively, and 9 miRNA were screened out respectively and the algorithms of integrating TargetScan and miRanda databases were obtained. Their target genes were predicted and miRNA-target regulatory network was constructed. Ssc-miR-30a-5p and ssc-miR-30d are the most down-regulated target genes in the PRV infection control network. Ssc-miR-10a-5p and ssc-miR-10b are at the core in the PRV-gEgl infection control network. There were 85 (60 up-regulated, 25 down-regulated) miRNA, in PRV-gEgl infection group as compared with PRV infection group. The significant difference of miRNA, indicated that gene deletion had different effects on the expression of miRNA. In order to understand the effect of the abnormal expression of miRNA on the virus, ssc-miR-34a,ssc-miR-19,ssc-miR-145-5p and ssc-miR-499-5p, were randomly selected to transfect them into the cells and inoculated with the virus at 12 h and 36 h, respectively. The results of fluorescence quantitative detection showed that ssc-miR-34a,ssc-miR-16 could inhibit the replication of PRV. In this study, the expression profiles of miRNA in PK-15 cells before and after PRV infection and PRV-gEgl infection were identified, and by comparing and analyzing them, the mechanism of pathogenetic host interaction was further understood, and a new understanding of the effect of gEgl on PK-15 cells was also obtained. The further analysis of the pathogen-host interaction mechanism based on miRNA can lay a foundation for the prevention and control of PRV from the point of view of miRNA, and can also provide theoretical reference for its application as vaccine, carrier or nerve conduction tracer.
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

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本文编号：2215583