重组牛脂多糖结合蛋白对脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的影响及其机制研究

发布时间：2018-09-14 20:37

【摘要】：本研究通过原核表达,重组牛脂多糖结合蛋白(recombinant bovine lipopolysaccharide binding protein,rbLBP)和点突变脂多糖结合蛋白(rbM-LBP)。在乳腺上皮细胞体外培养基础上,利用脂多糖(LPS)诱导奶牛乳腺上皮细胞,建立了乳腺上皮细胞炎症反应模型。同时采用基因芯片技术对炎症反应模型差异表达基因进行分析,探讨了LPS诱导炎症反应的关键因子及信号通路。并进一步通过不同浓度的rbLBP及不同的LBP作用于炎症反应模型,探讨LBP影响炎症反应的作用及其分子机制,为LBP的应用及防治牛乳腺炎提供一定的参考依据。1LBP载体制备、重组蛋白表达与纯化根据已知牛LBP基因序列及LBP第二外显子发生点突变的基因序列构建目的基因,并建立目的基因载体质粒pET22b,通过BL21大肠杆菌细胞为宿主的表达系统,IPTG诱导表达后纯化,得到高纯度的重组牛LBP蛋白和rbM-LBP蛋白,去除内毒素,通过免疫印迹分析鉴定重组蛋白。结果表明,本试验成功构建了载体质粒pET22b(+)-LBP和pET22b(+)-rbM-LBP,通过BL21大肠杆菌细胞表达和纯化,得到高纯度的rbLBP蛋白和rbM-LBP蛋白。2奶牛乳腺上皮细胞的优化培养及其炎症反应模型的建立选择健康中国荷斯坦牛,无菌采集乳腺组织,采用组织块接种法在DMEM培养液培养牛乳腺上皮细胞。细胞纯化后分别用β-酪蛋白和角蛋白鉴定,结果表明,奶牛乳腺上皮细胞纯度在95%以上,符合试验要求。LPS作用于牛乳腺上皮细胞12h,10、20、100μg/mL浓度的LPS处理组IL-1β、TNF-α表达及分泌均显著上升,浓度在1～10Oμg/mL范围内LPS作用有剂量依赖性,100μg/mL LPS处理组可能因细胞毒性的作用,IL-1β、TNF-α的表达有略微下降,但仍然显著高于对照组(P0.05)。结果表明,LPS浓度10μg/mL时显著提高IL-1β、TNF-α的表达及释放(P0.05),并致细胞早期凋亡发生。以上表明,本试验成功建立了奶牛乳腺上皮细胞原代培养体系及炎症反应模型。3 LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症反应模型基因表达谱分析为了进一步探讨和了解乳腺感染后的免疫反应,在LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞建立炎症反应模型的基础上。进一步通过表达谱基因芯片分析,从超过43000个记录中筛选了958个显著差异表达基因,其中LPS诱导后472个基因上调,486个基因下调。对差异表达基因进行GO分析,筛选参与防御、免疫、炎症反应的基因,KEGG分析发现Toll样受体途径和趋化因子途径响应LPS诱导的炎症反应过程。定量PCR验证芯片结果,发现TLR4、MyD88、NFKB、IL-1β、NOS2和TNF-α上调表达,并参与TLR4的信号通路,LPS诱导的乳腺上皮细胞TLR4和NF-kB蛋白表达上调。以上结果表明在LPS诱导的乳腺上皮细胞炎症反应中TLR4/NF-κB信号通路被激活,LPS可致上皮细胞炎性损伤。4重组牛脂多糖结合蛋白(rbLBP)对脂多糖(LPS)诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症反应模型的影响本试验通过不同浓度的重组牛脂多糖结合蛋白(rbLBP)作用于LPS诱导的牛乳腺上皮细胞炎症反应模型,探讨其可能的作用机制。结果显示,不同浓度(10和20μg/mL)的重组牛脂多糖结合蛋白(rbLBP)对牛乳腺上皮细胞没有细胞毒性,并可能会n弱LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤;下调toll样受体4(TLR4)、核因子kB(NF-kB)、IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)在乳腺上皮细胞中表达;减少IL-1β、TNF-α的分泌;下调TLR4和NF-kB(P65)的蛋白表达;核转录因子κB活性也被减弱。这些结果表明,高浓度的rbLBP减弱LPS诱导的牛乳腺上皮细胞炎症损伤作用,至少部分是通过减少促炎性细胞因子产生实现的;rbLBP被发现直接抑制LPS/TLR4介导的NF-κB活化,一种可能的抗炎机制可以归因于rbLBP对LPS介导的TLR4/NF-κB信号通路激活的负调控。5 rbLBP和rbM-LBP对脂多糖(LPS)诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症反应模型的影响本试验通过重组牛脂多糖结合蛋白(rbLBP)和重组牛点突变脂多糖结合蛋白(rbM-LBP)分别作用于LPS诱导的牛乳腺上皮细胞炎症反应模型,探讨其可能的作用机制。结果显示,20μg/mL的rbLBP、rbM-LBP分别下调LPS诱导的乳腺上皮细胞中IL-1β和TNF-αmRNA表达,均抑制乳腺上皮细胞TNF-α和IL-1β的分泌;均显著下调LPS诱导的TLR4、NF-κB(P65)的mRNA和蛋白表达(P0.05),抑制NF-κB(P65)的活化。20μg/mL的rbLBP和rbM-LBP均显著下调LPS诱导的细胞早期凋亡(P0.05)。20μg/mL的rbLBP与rbM-LBP比较,对相关因子的影响效果差异不显著(P0.05)。结果表明,LBP在乳腺上皮细胞抑制LPS诱导的炎症反应的机制,可能与其中和LPS活性、下调TLR4表达、抑制NF-κB信号激活、抑制炎症因子分泌和表达有关。重组的两个蛋白,rbLBP与rbM-LBP对炎症相关因子的影响效果差异不显著。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S823

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