腺病毒介导shRNA干扰绵羊MSTN基因效果及对生肌调节因子和干扰素反应基因表达的影响

发布时间：2018-10-05 16:30

【摘要】：旨在进一步揭示MSTN在绵羊成肌细胞中的调控机制,制备可有效失活MSTN基因的工具,为通过RNA干扰技术提高绵羊产肉量提供方法和理论依据。本研究以绵羊成肌细胞为试验材料,构建特异靶向绵羊MSTN基因的shRNA干扰质粒载体,将干扰效果好的质粒进一步包装为重组腺病毒,转染细胞后采用qRT-PCR和Western blot检测MSTN基因以及生肌调节因子和干扰素反应基因的表达。结果表明,质粒ShR218和ShR511干扰MSTN基因效率分别达到35%和48%,双元干扰质粒ShR3+4干扰效率最高达到85%。成功包装shRNA重组腺病毒载体Sh511和Sh3+4,病毒滴度达到1×10~8 pfu·mL~(-1),对成肌细胞的感染效率达到90%以上。Sh511和Sh3+4对MSTN基因mRNA的表达抑制分别达到53%和76%,对蛋白表达抑制分别达到55%和64%。MSTN基因沉默后,伴随着Myf5、MyoD、MyoG、Myf6基因mRNA水平的极显著性下调(P0.01),但只引起MyoG蛋白水平极显著升高(P0.01),未引起Myf5、MyoD、Myf6蛋白水平的显著变化;腺病毒感染成肌细胞未引起OAS1基因mRNA水平的显著变化,但引起IFNGR1基因mRNA水平的极显著升高(P0.01),对二者蛋白水平均无显著影响。本研究成功构建靶向MSTN基因的shRNA腺病毒载体,能有效抑制成肌细胞MSTN的mRNA和蛋白表达,并影响生肌调节因子Myf5、MyoD、MyoG、Myf6基因和干扰素受体基因IFNGR1表达。
[Abstract]:The aim of this study was to further reveal the regulatory mechanism of MSTN in sheep myoblast and to prepare a tool for inactivating the MSTN gene effectively, and to provide a method and theoretical basis for increasing the meat yield of sheep by RNA interference technique. In this study, sheep myoblasts were used as experimental materials to construct shRNA interference plasmid vector specifically targeting sheep MSTN gene. The plasmid with good interference effect was further packaged as recombinant adenovirus. After transfection, the expression of MSTN gene, myogenic regulatory factor and interferon response gene were detected by qRT-PCR and Western blot. The results showed that the interference efficiency of plasmid ShR218 and ShR511 reached 35% and 48%, respectively, and the interference efficiency of plasmid ShR3 4 reached 85%. The shRNA recombinant adenovirus vectors Sh511 and Sh3 4 were successfully packaged. The viral titer reached 1 脳 10 ~ (8) pfu mL~ (-1). The infection efficiency of myoblasts was over 90%. Sh511 and Sh3 4 inhibited the mRNA expression of MSTN gene by 53% and 76%, respectively. After 55% and 64%.MSTN gene silencing, The mRNA level of Myf5,MyoD,MyoG,Myf6 gene was significantly down-regulated (P0.01), but only the level of MyoG protein was significantly increased (P0.01), but no significant change of Myf5,MyoD,Myf6 protein level was caused by adenovirus infection of myoblast, but no significant change of mRNA level of OAS1 gene was found in adenovirus infected myoblasts. However, the mRNA level of IFNGR1 gene was significantly increased (P0.01), but had no significant effect on both protein levels. In this study, shRNA adenovirus vector targeting MSTN gene was successfully constructed, which can effectively inhibit the expression of mRNA and protein in myoblasts MSTN, and affect the expression of Myf5,MyoD,MyoG,Myf6 gene and IFN- receptor gene IFNGR1.
【作者单位】： 河北农业大学动物科技学院;河北省畜牧兽医研究所;
【基金】：国家肉羊产业技术体系资助项目(CARS-39)
【分类号】：S826

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本文编号：2254079