脱氧雪腐镰刀菌烯醇对PRRSV感染的影响及其机理研究

发布时间：2018-10-08 15:23

【摘要】：脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是由镰刀菌属真菌在生长过程中产生的次级代谢产物。DON属于天然化合物,化学结构特殊,人工合成较为困难。然而商品化DON价格昂贵,不能满足实验室大量DON毒理学研究的需要。DON可以通过污染的粮食作物引起人和动物的中毒。猪是对DON最敏感的动物,DON可以明显引起猪的拒食、体重下降等症状。DON有免疫调节的作用,高浓度的DON可导致免疫抑制,表现为循环淋巴细胞减少;低浓度的DON可以刺激某些细胞因于和炎症相关基因的表达。有报道表明,DON和某些镰刀菌属毒素可以增加机体对病毒的易感性。猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)是危害养殖业的一个重要病毒,可严重损害种畜的生殖机能和仔猪的呼吸功能。本研究制备纯化DON样品,并将其利用到毒理学研究中。研究了 DON对生长在细胞上的PRRSV复制的影响,DON对感染PRRSV的细胞的细胞因子mRNA表达的影响及细胞凋亡情况,探讨DON对PRRSV在体外复制的影响的机理。对感染PRRSV的仔猪饲喂含不同浓度的DON的日粮,研究DON在动物体内对PRRSV的感染的影响。试验Ⅰ小麦样品中DON的分离纯化禾谷镰刀菌PH-1产生的孢子液接种到小麦培养基上,小麦发生霉变后,HPLC测产毒量。霉变小麦粉碎后,加入乙腈/水(84:16,v/v)萃取液,经振荡、抽滤、脱脂、旋转蒸干后,得到棕色粘稠状浸膏。该浸膏与粗颗粒硅胶拌料后,经过第一次硅胶柱,分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇进行洗脱,TLC检测DON样品存在乙酸乙酯溶液中。浓缩该溶液,与较细颗粒的硅胶拌料后,经过第二次硅胶柱层析,用二氯甲烷/甲醇(19:1,v/v)作为洗脱液,得到DON的粗提物。粗提物经过制备型HPLC,收集含有DON单峰的样品,经分析型HPLC检测,与DON标准品有相同的出峰时间,可以初步判定该样品为DON。该样品经HPLC-MS、NMR结构鉴定,和间接竞争ELISA免疫学鉴定为DON。本研究中,1kg小麦培养基得到433 mg DON粗提物,经纯化后得到293 mg DON样品,本试验的回收率接近70%。经计算,该DON的纯度达90%以上,可以用来进行毒理学研究。试验ⅡDON对PRRSV在体外复制的影响为了研究DON对PRRSV体外复制的影响,本试验选取PRRSV的体外培养细胞MARC-145细胞进行研究。分别研究了不同浓度的DON对未感染病毒的细胞的活力LDH活性的影响;对已感染PRRSV的细胞的活力、LDH活性的影响;DON对接种在细胞上PRRSV抗原量以及病毒滴度的影响;DON对PRRSV N蛋白复制的影响。结果显示,较高浓度的DON(500～800ng·mL-1)可导致正常细胞的形态发生变化,甚至脱落;细胞的活力降低(P0.05);LDH活性升高(P0.05),因此本试验研究浓度小于500 ng·mL-1的DON对PRRSV复制的影响。PRRSV感染细胞后,出现明显细胞病变,加入50 ng·mL-1DON时,细胞的病变情况和细胞活力没有明显变化。当DON浓度为150～200 ng·mL-1时,感染PRRSV的细胞存在病变,但细胞活力显著高于对照组(P0.05);LDH活性显著低于对照组(P0.05);间接免疫荧光试验表明PRRSV抗原量减少;病毒滴度显著低于对照组(P0.05);Western blotting试验结果表明,N蛋白复制受到抑制。以上试验结果说明DON浓度为150～200 ng·mL-1时,可以抑制PRRSV在细胞上的复制。试验ⅢDON对感染PRRSV细胞的细胞因子及细胞凋亡的影响PAM为PRRSV感染的天然靶细胞,为了进一步探讨DON对PRRSV复制影响的机理,本试验研究DON对PAM的细胞因子mRNA表达的影响。分别研究了DON浓度为200 ng·mL-1时,对抗病毒细胞因子IFN-α和IFN-β和促炎性细胞因子IL-1β和IL-6的mRNA表达的影响。结果显示,对于未感染PRRSV的细胞,200 ng·mL-1DON染毒组的IFN-α和IFN-βmRNA表达水平与对照组无显著性差异;细胞感染PRRSV后,IFN-α和IFN-β相对表达水平有所升高,但与对照组差异不显著;感染PRRSV的细胞中加入DON后,IFN-α和IFN-β的表达水平升高,与对照组差异显著(P0.05),抗病毒细胞因子的升高与DON抑制PRRSV的复制有关。DON可以使未感染PRRSV的细胞中IL-1β和IL-6相对表达升高,与对照组差异显著(P0.05);PRRSV感染细胞中IL-1β和IL-6的mRNA表达水平升高,但与对照组无显著性差异;DON使感染PRRSV的细胞中IL-1β和IL-6的mRNA表达水平升高,与对照组差异显著(P0.05)。DON引起的炎性细胞因子的表达升高与其抑制PRRSV在细胞上的复制有关。本试验还应用流式细胞术检测了DON对感染PRRSV的细胞的凋亡情况。细胞感染PRRSV后,加入DON浓度为50 ng·mL-1时细胞凋亡率与不加DON的对照组差异不显著,DON浓度为150～200 ng·mL-1细胞凋亡率显著高于对照组(P0.05)。DON引起的细胞凋亡威胁细胞上PRRSV的存活,导致PRRSV在细胞上的复制受到抑制。试验ⅣDON对PRRSV体内感染的影响为了研究DON对PRRSV体内感染的影响,本试验选取28日龄断奶仔猪进行试验研究。将实验动物随机分为4组,每组10头猪,4组动物隔离饲养。试验组1为对照组,饲喂基础日粮。其余3组试验组的猪各滴鼻、肌肉接种1 mL JXA1株MARC-145细胞培养液,病毒滴度为1×105TCID50·mL-1。试验组2饲喂基础日粮;试验组3饲喂基础日粮添加3 mg·kg-1 DON;试验组4饲喂基础日粮添加5 mg·kg-1 DON。分别测量4组实验动物的生长性能、体温、血液及肺脏样本中的PRRSV病毒载量、血清样本中抗PRRSV特异性抗体的免疫应答及免疫组化检测肺组织中的PRRSV含量。结果显示,饲喂添加DON的日粮可导致感染PRRSV的仔猪生长性能降低;体温升高;血液中PRRSV病毒载量增加;肺脏组织中PRRSV含量增加;血清中针对PRRSV的特异性抗体应答增强。感染PRRSV的仔猪饲料中添加DON导致仔猪PRRSV感染的症状加剧,甚至死亡。本试验结果与体外试验结果相矛盾,这是由于体内和体外试验环境不同引起的,本试验中日粮中添加DON的浓度尚未达到DON对PRRSV复制的抑制作用,DON在该浓度作用主要发挥引起动物拒食、呕吐等毒性作用。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.28

【参考文献】