猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白PalA对灭活疫苗的免疫干扰

发布时间：2018-10-09 08:17

【摘要】：猪胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)所造成的一种猪呼吸道疾病。该病在1957年Pattison第一次报道,目前已经遍布在全世界的各地,导致养猪行业的巨额经济损失。因为传统的抗生素能够所引起细菌的耐药性,而且现代人极为广泛关注绿色食品的安全问题,现阶段预防和治疗胸膜肺炎病普遍使用的方法就是接种疫苗。在1996年Frey从胸膜肺炎放线杆菌中克隆了一种脂蛋白PalA,其大小约是14 kDa, PalA与流感嗜血杆菌P6蛋白和一种巴氏杆菌外膜蛋白同源性比较高,而后两种已经被证明是保护性蛋白,另外大量的实验结果也表明有许多种类的革兰氏阴性细菌中的PAL蛋白家族具有比较强的免疫原性特点,因此我们的目的蛋白PalA很有可能是治疗猪胸膜肺炎候选亚单位疫苗的有效组成部分,令科学家惊奇的是,Frey在2003年的实验研究中发现这种脂蛋白PalA对于亚单位疫苗有免疫有不利影响,我们知道目前灭活疫苗成本低而且在生产实际中使用比较多,本研究主要是借助小鼠模型来探究PalA蛋白对于灭活疫苗免疫效力的影响。首先,本实验对目的基因palA进行克隆和目的PalA蛋白表达纯化,利用新西兰大白兔为实验对象进行兔多克隆抗体的制备,实验组的2只新西兰大白兔用PalA免疫四次,另外一只免疫PBS作为阴性对照实验,第二次加强免疫后的第十四天,将兔子动脉放血后进行血清的彻底分离,然后利用96孔ELISA板测定制备的多克隆抗体血清的效价高低,我们实验的测定结果1：25600,另外,实验中提取了胸膜肺炎放线杆菌1型SLW01菌株的亚细胞的各个成分,通过Western blotting分析最终显示了目的PalA是一种外膜蛋白。其次,我们利用纯化的重组蛋白rPalA和胸膜肺炎放线杆菌SLW01灭活菌苗进行了不同组合的皮下免疫小鼠后腹腔攻毒,实验中选取了40只生理状况相同的6周龄大的Balb/C雌性小鼠分成5个小组,第一组是用PBS免疫的对照组,第二组是rPalA组,第三组是胸膜肺炎放线杆菌的SLW01灭活菌苗Bac组,第四组是蛋白疫苗混合BacPal组,第五组是胸膜肺炎放线杆菌的商品三价疫苗ComV组。免疫分三次进行,每次的中间间隔时间是14天,第2次加强免疫两周后,以～5×LD5o剂量(2.5×106CFU)的APP血清1型4074菌株腹腔攻毒,攻毒后记录小鼠在一天后的体重变化和小鼠5天内的死亡数量,计算各组小鼠的体重损失率和存活率,依据这些指标分析目的蛋白rPalA对于灭活疫苗免疫效果的影响,每次免疫前和攻毒前对小鼠进行尾部的静脉取血并且分离血清,利用间接ELISA测定小鼠血清对于三种不同的抗原rPalA, ApxIA, ApxIIA的抗体水平。实验结果显示,第二组的PalA抗体效价极显著高于第三组(P0.01),然而,第三组灭活疫苗组却显示了比较高的外毒素ApxIA和ApxIIA的抗体效价,最后一次免疫后外毒素的抗体效价差异达到了极显著水平(P0.01)。另外,第三组的免疫小鼠经过APP血清1型4074菌株的攻击后,表现了100%的保护,而BacPal免疫的小鼠仅仅提供75%的保护,除此之外,相对于灭活疫苗组,BacPal免疫的小鼠体重损失显著(P0.05)。最后,我们用24只生理状况相同的6周龄Balb/C雌性小鼠为实验对象进行了被动免疫实验,将实验动物随机平均分成3组,分别用不同的抗血清皮下免疫,第一组免疫融合蛋白rPalA的抗血清,第二组免疫灭活的胸膜肺炎放线杆菌血清1型SLW01菌的抗血清,第三组免疫灭活APP SLW01菌和rPalA混合抗血清,免疫抗血清3 h后,用APP血清1型菌株4074以～5×LD5o(2.5×106 CFU)进行腹腔攻毒,记录小鼠5天内的死亡率,并用福尔马林将死亡小鼠的肺部固定然后制作病理切片,切片用HE染色后镜检观察。实验结果表明,灭活疫苗组抗血清,BacPal的抗血清分别提供了的100%、37.5%的保护,病理切片的结果显示灭活疫苗和目的融合蛋白rPalA混合的抗血清的肺部病变更加严重,肺部组织有出血和渗出的纤维蛋白。总之,我们的实验结果表明目的蛋白PalA不是免疫保护性的抗原,PalA抗体能够对Apx毒素抗体的产生不利的负面影响和削弱灭活疫苗的免疫效力。
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【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.4

【参考文献】