重组大肠杆菌不耐热肠毒素Ⅱ型蛋白部分生物活性研究

发布时间：2018-10-09 10:08

【摘要】：犊牛大肠杆菌性腹泻是由致病性大肠杆菌引起的新生幼犊的一种急性传染病,主要表现为腹泻,严重者因功能衰竭、脱水和酸中毒而死亡,也有的表现为败血症症状,常给养牛业带来严重的经济损失。引起犊牛腹泻的大肠杆菌主要毒力因子有肠毒素(不耐热肠毒素和耐热肠毒素)、志贺毒素和黏附素,其中不耐热肠毒素II型(Type II heat-labile enterotoxin,LT-II)可引起犊牛严重的腹泻。国内外对于LT-II相关研究较少,因此,深入研究LT-II的生物学活性可对防治大肠杆菌性犊牛腹泻具有重要意义,为犊牛大肠杆菌性腹泻疫苗研究奠定基础。本研究通过对2010-2012年东北地区12个规模化养牛场犊牛腹泻粪便中分离的381株大肠杆菌样品进行LT-II基因的PCR检测,有10株大肠杆菌带有LT-II基因。核苷酸序列分析结果显示,8株为LT-IIc1基因、1株为LT-IIc4基因、1株为LT-IIc6基因。将优势基因型LT-IIc1毒素基因双顺反子的ORF克隆入p ET30a表达载体,转化Rossatta感受态细胞并诱导表达r LT-IIc1重组蛋白,同时构建了LT-IIc1A、B亚基的原核表达系统BL21/pHUE-LT-IIc1-A、BL21/p HUE-LT-IIc1-B和BL21/pGEX-6p-1-LT-IIc1-B,并对应表达r LT-IIc1-A、r LT-IIc1-B和rpLT-IIc1-B。用Y-1细胞检测rLT-IIc1对细胞的毒性作用。将r LT-IIc1、r LT-IIc1-A、r LT-IIc1-B三种重组蛋白与白油佐剂1:1混合后,分别进行腹腔注射和滴鼻免疫6周龄小鼠,用间接ELISA定期检测血清中特异性Ig G和IgA抗体水平;Y-1细胞体外中和试验检测高效价小鼠血清的中和效价。选取8月龄海兰褐蛋鸡,用以上三种抗原进行胸肌注射免疫,定期收集鸡蛋,用间接ELISA检测卵黄抗体效价;Y-1细胞体外中和实验检测高价卵黄抗体中和效价。SDS-PAGE分析和Western blot鉴定结果显示,以上四种重组蛋白均获得高效表达。细胞毒性试验显示,r LT-IIc1可以使Y-1小鼠肾上腺皮质细胞发生明显的病变,其细胞最小致死量为17.8pg。间接ELISA检测结果表明,在腹腔注射途径中,r LT-IIc1免疫组小鼠血清中特异性Ig G效价水平最高,A亚基效价为1:10610、B亚基效价为1:14400,高于其他免疫组;在滴鼻免疫组中,LT-IIc1重组蛋白组小鼠血清中特异性Ig A效价也为最高,A亚基滴度为1:3400、B亚基滴度为1:3600,同样也高于其他免疫组各组。体外中和试验结果显示,腹腔注射组中r LT-IIc1组小鼠血清抗体中和效价为1:52。在三种免疫原免疫蛋鸡后均在三免后14d卵黄抗体水平达到最高,其中r LT-IIc1组卵黄抗体水平较高,A亚基为1:6120、B亚基为1:8630;重组蛋白B亚基组卵黄抗体效价高达1:9670;重组蛋白A组卵黄抗体效价仅为1:3600;各组高效价卵黄抗体体外中和试验结果显示,rLT-IIc1组中和效价为1:24;r LT-IIc1-A组中和效价为1:7;r LT-IIc1-B组中和效价为1:19。研究表明r LT-IIc1对Y-1细胞具有细胞毒性作用,并对小鼠和鸡均有良好的免疫原性,免疫血清和卵黄抗体对LT-II具有中和作用。该研究为犊牛大肠杆菌性腹泻疫苗抗原基因的选择奠定了基础。卵黄抗体对LT-II较好的中和作用,为临床防治犊牛大肠杆菌性腹泻提供了潜在的生物制剂和对LT-II的检测抗体。
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【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61

【参考文献】