【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的病原,疾病主要特征是母猪流产和仔猪呼吸道疾病。该病在猪群中广泛传播,严重影响全球养猪业的发展,也是猪病防控的一大难题。目前对该病尚无有效的治疗手段,在实践中需采用综合防治措施才能有效降低或阻断本病的发生与传播。为了减少PRRS造成的不利影响,更好的控制本病,亟待对PRRSV的致病机制进行更深入的了解与研究。在真核细胞中,细胞生长与分裂是以细胞周期的形式进行的。细胞周期检查点(cell cycle checkpoint)作为负反馈调节机制,确保了细胞周期事件正确合理运行。当DNA发生损伤时,这些检查点被激活发挥作用,细胞周期运行被阻断,细胞完成修复保证细胞周期正常运转,若损伤不能及时修复会导致细胞凋亡。损伤引起的细胞周期停滞激活相关的信号通路,进而影响细胞周期调控蛋白的表达或磷酸化水平发挥作用的。众多研究表明,在感染过程中,许多病毒及其相关蛋白可以扰乱细胞周期和诱导细胞凋亡。尽管有关PRRSV致病机制的研究报道已经很多,但PRRSV感染对细胞周期的影响及其机制目前却鲜有报道。本研究以PRRSV感染MARC-145细胞,探索PRRSV感染对细胞周期的影响及其机制,主要内容如下:1.用PRRSV SD16株感染MARC-145细胞,在倒置显微镜下观察到明显的细胞病变,采用IFA和Western blot技术检测到病毒感染细胞中存在大量的PRRSV N蛋白。2.根据Cell Counting Kit-8(CCK-8)说明,绘制MARC-145细胞数与450 nm吸光度值(OD450nm)的标准曲线并获得回归方程“y=0.3098 ln(x)-1.7214,R2=0.998”;以不同感染复数(Multiplicity of Infection,MOI)PRRSV SD16株感染MARC-145细胞,检测感染后不同时间的OD450nm,根据回归方程,计算感染后不同时间的细胞数发现,不同剂量PRRSV SD16株感染MARC-145细胞,均可抑制细胞的增殖,综合考虑选择1 MOI感染剂量。3.通过Annexin V-PI双染发现,PRRSV感染可诱导MARC-145细胞凋亡,且凋亡细胞数随着感染时间的延长不断增加。PI染色和流式细胞术检测发现,PRRSV感染可导致MARC-145细胞周期阻滞在G2/M期。4.IFA和Western blot技术检测显示,PRRSV感染引起MARC-145细胞中CyclinB1表达丰度升高且移位于细胞核;Cdc2磷酸化(p-Cdc2)(Tyr15)水平升高且核分布增加;p53总表达量及p-p53(Ser15)的表达均显著增加;14-3-3σ的表达显著增加。Western blot及CoIP技术检测发现,p21表达显著升高且p21与Cdc2-CyclinB1复合物之间存在互作。表明PRRSV感染导致的MARC-145细胞周期G2/M期阻滞与p53/p21信号通路活化有关。5.通过qPCR和Western blot技术对转录水平及蛋白表达水平分析发现,PRRSV感染的MARC-145细胞中,Wee1、Myt1转录水平差异无统计学意义而蛋白表达水平均增加;Cdc25C表达变化不明显,但p-Cdc25C(Ser345)表达显著升高且主要分布于细胞质中;Chk1和p-Chk1(Ser345)的表达水平增加非常明显。表明PRRSV感染导致的MARC-145细胞周期G2/M期阻滞与Chk/Cdc25信号通路活化有关。综上所述,PRRSV感染MARC-145细胞通过活化p53/p21信号通路和Chk/Cdc25信号通路,诱导细胞周期阻滞在G2/M期。
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【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.28
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