流行性乙型脑炎病毒单克隆抗体的制备与prM-E蛋白抗原捕获ELISA检测方法的建立

发布时间：2018-10-25 15:46

【摘要】：流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)是一种危害严重的蚊媒性人兽共患传染病,广泛流行于亚洲大部分地区和西太平洋地区,近年来,在澳大利亚北部和巴基斯坦的传播表明该病的流行范围在不断扩大。JEV不仅严重威胁人类的健康,而且会对养猪业造成巨大的经济损失。建立以单克隆抗体为基础的抗原抗体检测方法则是预防控制该病毒病的重要手段。本课题组已经构建了稳定表达JEV pr M-E蛋白的哺乳动物细胞系,该细胞系表达的pr M蛋白和E蛋白能够组装成与JEV病毒粒子具有近似构象结构的病毒样颗粒(VLP)并分泌至细胞培养液中。本研究将该细胞系表达的JEV-VLP纯化后作为免疫原,免疫6~8周龄BALB/c雌鼠,经淋巴细胞杂交瘤融合技术、亚克隆和间接ELISA方法进行筛选后,获得了8株能稳定分泌JEV pr M-E蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1B5、3A7、4C6、5B10、5E7、11C2、12D10、18A7。间接ELISA检测结果表明杂交瘤细胞培养上清的抗体效价介于1:64~1:2 048之间,腹水的抗体效价介于1:51 200~1:204 800之间。以HBT试剂盒对单克隆抗体亚型进行鉴定,结果表明除12D10株单克隆抗体亚类为Ig G2b外,其余7株单克隆抗体亚类均为Ig G1,轻链均为κ链。Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)结果表明8株单克隆抗体均能够识别JEV的天然构象表位,5E7还能够识别JEV的线性表位。此外,单克隆抗体4C6和12D10为JEV特异性单克隆抗体,与西尼罗病毒pr M-E抗原没有交叉反应。JE没有特异治疗方法,疫苗免疫是预防控制JEV感染的最为有效的措施。JEV pr M-E抗原免疫原性强,有望开发为JE亚单位疫苗。在亚单位疫苗的研发中,对疫苗抗原的检测是重要的质量控制技术手段。本研究从8株单克隆抗体中筛选出效价高的5B10和5E7,并将其腹水以Protein G进行了纯化。以单克隆抗体5B10作为包被抗体,以单克隆抗体5E7进行辣根过氧化物酶(HRP)标记作为检测抗体,并将以凝胶过滤柱层析法纯化的JEV pr M-E蛋白作为标准抗原,建立了JEV pr M-E蛋白抗原捕获ELISA方法,用于定量JEV pr M-E亚单位疫苗抗原。对ELISA方法的各个条件进行优化后,确定了以下的最佳反应条件:包被液为50 mmol/L p H9.6碳酸盐缓冲液,单克隆抗体5B10包被量为0.6μg/孔,4℃过夜;封闭液为0.5%聚乙烯醇(PVA),37℃封闭2 h;待检抗原以0.5%牛血清白蛋白(BSA)稀释,37℃反应2 h;HRP-5E7按1:500比例稀释,37℃作用1 h;TMB底物室温显色8 min。敏感性试验表明,该方法的检测限度为48.44 ng/m L,最佳定量范围为0.05~1.00μg/m L,建立的标准曲线的线性相关系数能够达到99%以上。重复性试验表明,同一样品的批内和批间变异系数均小于10%。特异性试验表明,该方法与其它常见猪病病原无交叉反应。包被抗体的酶标板可以在37℃耐受至少一个月而结合抗原能力不变。组装的试剂盒置4℃保存1年稳定。JEV pr M-E结构蛋白特异性单克隆抗体的制备为新的JEV特异性抗原抗体检测方法的研究奠定了基础。同时,JEV pr M-E亚单位疫苗抗原捕获ELISA检测试剂盒的研制,为JEV亚单位疫苗研发过程中的质量控制提供了技术支持与保障。单克隆抗体的制备与抗原捕获ELISA检测方法的建立对JE的防治与检测具有重要的公共卫生学意义。
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【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

【参考文献】