鹦鹉热衣原体毒力相关CT135同源基因的致病机制研究

发布时间：2018-11-01 15:23

【摘要】：鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci, Cps)是一种专性细胞内寄生、具有独特二相发育周期的人兽共患病原菌。根据最新分类方法,Cps归类到衣原体属、衣原体科、衣原体目。20世纪30年代Cps曾在12个国家发生大流行,特别是1930年美国马里兰州的Cps疫情直接促使了美国国立卫生研究院(NIH)的成立。Cps广泛感染动物,可导致流产、关节炎等疾病,人类不是Cps的天然宿主,可因吸入分泌物或与鸟类的密切接触而感染,引起肺炎等疾病,称为鹦鹉热。其传播途径广泛,人类可通过气溶胶、皮肤、粘膜、眼结膜和伤口等引起感染,重症感染可出现全身中毒症状、急性肾功能衰竭、胰腺炎等,甚至死亡。由于易通过气溶胶—呼吸道途径传播和高致病性,Cps是被列入国际《禁止生物武器公约》的经典生物战剂和生物恐怖剂。由于培养纯化困难、对生物安全条件要求高、属生物恐怖剂范畴等原因,国内外只有极少数实验室从事Cps基础研究。国内外口前还没有Cps特有毒力基因的报道,对Cps致病机制的理解主要来自对其它衣原体种特别是沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, Ct)的研究。Ct是沙眼和最常见的性传播疾病的病原体。本课题研究对象是Cps的CT135同源基因,这是因为CT135是新发现的Ct毒力基因,有三个表型：(1)在未经体外培养的临床样本中,CT135基因是完整的：(2)具有完整CT135基因的Ct在细胞上连续传代时,会自然发生无义突变并获得生长优势；(3)不可思议的是,两株同时发生CT135移码突变的Ct D型菌株在雌鼠生殖道感染模型中有显著的毒力差异。目前Ct CT135基因是否编码蛋白质、蛋白质的定位、蛋白质的功能、其它衣原体种的同源基因是否有类似表型等都还不清楚。本课题目的是分析国内Cps流行株的CT135同源基因的多态性、体外稳定性、蛋白质的表达和定位,并探索构建Cps CT135同源基因的无义突变体,以加深理解CT135及其同源基因的致病机制。在Ct基因组上,CT134、CT135、CT136三个功能未知的基因可能组成一个操纵子,这三个基因的Cps同源基因分别为B598_0589、B598_0590和B598_0557,它们的氨基酸同源性分别为26%,21%和65%。鉴于Ct的这三个基因可能组成操纵子,本课题分析了这三个同源基因的蛋白质表达和定位。本课题首先建立了基于Cel Ⅰ酶的单核苷酸突变检测技术,分析了库存Cps菌株B598_0590基因的多态性和体外稳定性。利用硫酸铵沉淀法从西芹汁中提取了Cel Ⅰ酶,经杂合双链DNA酶切鉴定,提取的Cel Ⅰ酶具有良好的单核苷酸突变检测活性。用Cel Ⅰ酶对库存九株Cps的B598_0590基因进行了突变分析,发现库存Cps菌株的B598_0590均不存在多态性,进一步基因测序分析发现所有菌株均编码完整的B598_0590,测序图谱上各碱基无明显重叠峰(这与Cel Ⅰ结果相一致)。考虑到国内Cps菌株均为鸡胚分离和传代,而不是国外常用的细胞法,而Ct CT135基因多态性在鸡胚模型中还缺乏研究。我们利用乙基乙烷磺酸酯(EMS)处理Cps CG1株后,分成24组在Vero细胞上连续传代20次,使CG1株适应Vero,然后进行基因测序分析,发现24组CG1的B598_0590均保持完整。显然,以上发现与Ct中报道的CT135的体内外不稳定性不一致。衣原体在特有的包涵体内增殖,其蛋白质可定位于菌体内部及表面、包涵体腔及包涵体膜、和细胞质。定位于包涵体膜和细胞质的衣原体蛋白可与细胞质直接接触,被认为与调控宿主信号通路相关。本课题利用原核表达载体pGEX-4T-1和pEASY-Blunt E1表达纯化了Cps CG1株的B598_0589、B598_0590、B598_0557、包涵体膜蛋白IncA、主要外膜蛋白MOMP和分泌蛋白CPAF,免疫小鼠制备了抗血清。采用共聚焦免疫荧光法,在感染后30小时,发现B598_0590的染色特征与IncA相似之处是包涵体膜浓染,这表明B598_0590编码包涵体膜蛋白；二者不同之处是多数包涵体内部也有B598_0590着色,说明该蛋白可能也在菌体或包涵体腔内分布。B598_0589与B598_0557的染色特征与MOMP相似,说明它们可能为菌体膜蛋白。免疫印迹实验进一步确认了抗血清的特异性,且没有发现三个功能未知蛋白存在翻译后修饰。Cps B598_0590编码包涵体膜蛋白的发现在LpxC抑制剂和青霉素测试实验中得到了进一步验证。青霉素不影响Ct包涵体的生长、染色体复制但可有限影响菌体分裂及网状体至原体的转化,此时网状体体积显著增大。LpxC抑制剂是一种新型抗生素,可抑制细菌类脂A的合成。据报道,该抗生素不影响Ct的包涵体发育和正常生长分裂,但会显著抑制网状体至原体的转化和菌体感染性。这两种药物对Cps生长发育的影响还缺乏研究,但如果导致菌体体积增大会有助于分析比较蛋白质的定位。本研究发现LpxC抑制剂和青霉素均可显著抑制CG 1的菌体分裂和包涵体生长,共聚焦免疫荧光发现两种抗生素对CG1蛋白质的表达有不同的影响。例如,青霉素可完全抑制IncA的分泌,而LpxC抑制剂处理的CG1仍能将IncA分泌至包涵体膜,形成典型的空泡结构。重要的是,经LpxC抑制剂处理的CG1经B598_0590抗血清染色后也能形成类似IncA染色的空泡结构,这进一步证实了B598_0590编码包涵体膜蛋白。以上发现Cps B598_0590编码包涵体膜蛋白也与生物信息学分析结果相一致。据文献报道,包涵体膜蛋白含有一段约60个氨基酸组成的两个连续的疏水裂片(lobe)。经比对预测,CT135同源基因在衣原体属内的12个种都存在,且有相似的疏水特征,它们都有相同大小的两个连续的疏水裂片。研究者利用此特征已在Ct中鉴定了多个包涵体膜蛋白,并预测Ct的CT134、CT135均编码包涵体膜蛋白,但没有对这两个蛋白进行鉴定。本研究发现,Cps B598_0589、 B598_0590分别与CT134、CT135同源,但只有B598_0590是包涵体膜蛋白。为进一步比较Cps与Ct包涵体膜蛋白的种类和同源性,研究中对Cps GR9株基因组中的所有假设蛋白和膜蛋白进行了疏水性分析,与基因组中注释的三个包涵体膜蛋白一起,共发现了46个可能的包涵体膜蛋白。这些蛋白中,除了已明确IncA与包涵体融合有关,其它均为功能未知蛋白。而且,只有21个Cps包涵体膜蛋白在Ct中有同源蛋白,B598_0590即是其中之一,这21个蛋白在衣原体属中全部存在同源蛋白,这说明这些少数同源的包涵体膜蛋白高度保守,可能有类似的功能、可能与对人的致病性相关,而多数没有同源性的包涵体膜蛋白可能与衣原体的宿主特异性有关。为进一步研究B598_0590的功能,本研究探索了TargeTron基因敲除技术在Cps中的应用。首先设计了B598_0590基因的Ⅱ型内含子插入位点和引物,构建了基于pACD4K-C的敲除载体,并在E. coli中验证了敲除载体插入灭活质粒载体携带的B598_0590基因的可行性。目前Ct的质粒转化多使用p-内酰胺酶作为筛选标记,因此用Mlu Ⅰ切除了敲除载体的卡那霉素抗性基因,并重新引入了p-内酰胺酶基因,在此基础上将Ⅱ型内含子的启动子在T7基础上分别增加CpsB598_0249基因或ompA基因的启动子,从而完成了基于两个Cps内源启动子的B598_0590敲除载体的构建,这为下一步构建Cps突变体奠定了基础。为制备衣原体属特异性的LPS表位抗原和抗体,本研究利用TargeTron技术初步构建了表达衣原体LPS表位的大肠杆菌突变体。衣原体的LPS实质上是由数个Kdo组成的脂寡糖,衣原体属内各种的LPS均有保守且特殊的a-Kdo-(2→8)-a-Kdo结构,该表位由多功能的Kdo转移酶KdtA负责合成。先用T载体将Ct L2的kdtA基因克隆入E. coli BL21(DE3),然后利用TargeTron技术在E. coli的内源kdtA基因内插入Ⅱ型内含子,获得了突变体E. coli kdtA::GⅡ CtkdtA。免疫荧光实验表明该突变体可表达衣原体属特异性的Kdo表位。将该E. coli突变体甲醛灭活后免疫小鼠,获得的免疫血清可与Cps发生特异反应,说明重组的Kdo表位具有良好的免疫原性,可用于制备衣原体属特异性抗体。综上所述,本研究建立了基于Cel Ⅰ酶的单核苷酸突变检测技术,可用于今后建立基于TILLING的Cps反向遗传学技术；利用Cel Ⅰ酶和测序方法分析了国内Cps流行株的基因多态性和体外细胞模型上的稳定性,发现国内Cps菌株的CT135同源基因均保持完整,在Vero细胞上CG1株的CT135同源基因可能与生长适应性无明显关联：采用生物信息学方法预测了Cps编码的所有包涵体膜蛋白,并通过生物信息学方法、共聚焦免疫荧光、青霉素和LpxC抑制剂测试实验一致发现Cps的CT135同源基因B598_0590编码包涵体膜蛋白,而Cps的CT134、 CT136同源基因可能编码膜蛋白；构建了重组表达B598_0589、B598_0590、 B598_0557、IncA、MOMP、CPAF和衣原体属特异性Kdo表位的E. coli工程菌、两个不同的B598_0590基因敲除质粒,为深入研究Cps CT135同源基因的功能奠定了基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.67

【相似文献】