牛单核细胞趋化蛋白1单克隆抗体的制备及其初步应用

发布时间：2018-11-05 16:18

【摘要】：单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)是趋化因子CC亚家族的一员。MCP-1主要趋化单核细胞和T淋巴细胞,使各种炎性细胞尤其是单核细胞向病变部位聚集,从而在机体防御、慢性炎症及抗肿瘤等方面起重要作用。血液中的单核细胞在特异的趋化因子作用下,发生迁移并聚集在不同病变组织中发挥重要的生物学效应,如吞噬和杀伤病原微生物,递呈抗原及分泌多种生物活性物质等。本研究克隆表达了牛MCP-1基因并制备了牛MCP-1单克隆抗体,为MCP-1在治疗炎症疾病、免疫诊断研究中提供了重要的生物材料。1.牛MCP-1基因的克隆及表达用ConA刺激健康荷斯坦奶牛外周血淋巴细胞,并提取细胞总RNA,以RT-PCR方法反转录为cDNA,再以cDNA为模板成功扩增到所需不含信号肽(BoMCP-1)和含信号肽(BoPreMCP-1)目的基因,同时还扩增了 GFP-BoPreMCP-1基因。将BoMCP-1基因分别与表达载体pET-30a(+)和pGEX-6p-1相连接构建重组质粒,将BoPreMCP-1基因与载体pVAX1相连构建重组质粒,并进行双酶切以及测序鉴定,鉴定结果通过DNA star软件分析均正确,无任何突变。构建成功的重组质粒分别命名为pET-30a-BoMCP-1、pGEX-6p-1-BoMCP-1、pVAX1-BoPreMCP-1 和 pVAX1-GFP-BoPreMCP-1。将原核表达载体转入宿主菌后,经0.5 mM/L IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析,出现预期的目的条带,条带大小分别为17kDa和36 kDa左右。通过免疫亲和层析法进行蛋白的纯化,Western blot结果显示纯化蛋白具有良好的免疫反应性,说明重组蛋白rHis-BoMCP-1和rGST-BoMCP-1均成功获得表达。2.牛MCP-1单克隆抗体的制备与初步应用将纯化得到的重组蛋白rHis-BoMCP-1免疫6周龄BALB/c小鼠,经3次免疫后,运用淋巴细胞杂交瘤技术融合细胞,以纯化重组蛋白rGST-BoMCP-1为检测原,运用间接ELISA方法筛选阳性克隆,经过3次亚克隆后,共获得3株能稳定分泌特异性BoMCP-1单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3D10、4G9和6F5。亚型鉴定结果显示3D10和4G9单抗为IgA亚型,6F5为IgG1亚型。间接ELISA测定效价结果显示6F5单抗上清效价为3200,3D10和4G9上清效价均为12800;制备上述三株单抗腹水,间接ELISA测定其效价,除了 6F5的腹水效价较低为32000,3D10和4G9腹水效价分别为256000和512000。间接ELISA还显示除6F5单抗与毕赤酵母表达的商品化牛MCP-1的反应性一般,3D10和4G9单抗与毕赤酵母表达的商品化牛MCP-1的反应性较好。Western blot结果显示所获得的3株单抗均与融合蛋白rHis-BoMCP-1和rGST-BoMCP-1发生反应。构建成功的pVAX1-GFP-BoPreMCP-1转染293T细胞后,间接免疫荧光分析单抗与MCP-1蛋白的反应性,结果显示3株单抗均与真核表达的GFP-BoPreMCP-1有很好的反应性。应用流式细胞术结合胞内染色技术分析单抗与天然牛MCP-1蛋白的反应性,首先对3株抗体进行流式细胞术方法的筛选优化:①选择两种不同的细胞的刺激剂ConA和LPS;②设置不同的抗体浓度,从而得到比较稳定的流式结果。结果显示只有4G9与天然BoMCP-1有较好的反应性。将4G9抗体应用于牛结核病的诊断,建立基于特异性抗原的流式细胞检测方法。采集经过TST和牛结核丫干扰素ELISA检测试剂盒验证的牛结核阳性和牛结核阴性的牛外周血,用特异性抗原ESAT-6/CFP-10重组蛋白刺激牛外周血单个核细胞后,使用4G9单抗进行流式细胞术检测,结果表明基于单抗4G9的流式细胞术具有较好的应用潜能。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.4

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本文编号：2312613