马疱疹病毒1型囊膜蛋白gD多克隆抗体制备及亚细胞定位

发布时间：2018-11-07 20:00

【摘要】：本研究通过间接免疫荧光技术,确定了EHV-1囊膜蛋白gD单独表达于BHK-21细胞内的亚细胞定位情况,为其亚细胞定位机制及病毒二级囊膜的研究奠定了基础。以EHV-1基因组为模板,利用PCR方法扩增gD部分基因,并构建其原核表达载体pET28-gD,转入BL21(DE3)感受态细胞内进行诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析法纯化gD重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫实验小鼠并制备抗囊膜蛋白gD的多克隆抗体;分别以间接ELISA方法及Western blot方法检测抗体效价及反应性;人工转染pVAX-Kozak-gD重组质粒至BHK-21细胞,利用IF技术对囊膜蛋白gD进行亚细胞定位。结果表明:成功表达了大小约29kD的gD重组蛋白;制备的多克隆抗体效价为1∶102 400,能较好地与囊膜蛋白gD真核表达产物特异性结合;通过IF方法确定囊膜蛋白gD大部分呈斑点状分布于宿主细胞核周围的胞质中,极少量定位于细胞核内。
[Abstract]:In this study, the localization of EHV-1 envelope protein gD in BHK-21 cells was determined by indirect immunofluorescence technique, which laid a foundation for the study of its subcellular localization mechanism and the study of virus secondary envelope. Using EHV-1 genome as template, some gD genes were amplified by PCR method, and its prokaryotic expression vector pET28-gD, was constructed for expression in BL21 (DE3) receptive cells. GD recombinant protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography. The purified recombinant protein was used as antigen to immunize mice and the polyclonal antibodies against gD were prepared, and the titers and reactivity of the antibodies were detected by indirect ELISA and Western blot, respectively. PVAX-Kozak-gD recombinant plasmid was artificially transfected into BHK-21 cells and subcellular localization of envelope protein gD was performed by IF technique. The results showed that the recombinant gD protein of about the size of 29kD was successfully expressed, and the polyclonal antibody titer was 1: 102,400, which could bind well with the eukaryotic expression product of gD. By IF method, most of the gD were speckled in the cytoplasm around the host nucleus, and a very small number of them were located in the nucleus.
【作者单位】： 新疆农业大学动物医学学院;新疆医科大学药学院;新疆维吾尔自治区药物研究所;
【基金】：新疆维吾尔自治区高等学校科研计划(项目号:XJEDU2014S024),题目:马疱疹病毒Ⅰ型囊膜蛋白gD亚细胞定位研究 新疆维吾尔自治区大学生创新项目(项目号:201610758167),题目:马疱疹病毒Ⅰ型囊膜蛋白gD的原核表达~~
【分类号】：S852.652

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本文编号：2317420