酵母双杂交技术筛选鸭圆环病毒Cap蛋白互作的宿主蛋白

发布时间：2018-11-09 08:59

【摘要】：鸭圆环病毒Cap蛋白是病毒重要的结构蛋白,组成病毒的衣壳,在宿主免疫应答中起着重要作用,为探究其与宿主蛋白之间的相互作用,以期了解该蛋白在病毒入侵机体过程中发挥的功能。本论文以鸭圆环病毒Cap蛋白为诱饵,从感染鸭圆环病毒的鸭脾脏的酵母双杂交cDNA文库中筛选与其有相作的宿主蛋白质,为进一步研究其在入侵宿主中的作用奠定基础。1.Cap蛋白多克隆抗体的制备将Cap基因优化的密码子1-108 bp片段与未优化109-774 bp的片段进行融合PCR后,连接至PGM-T载体,再亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,得到重组表达质粒PET32-CapY108,经菌落PCR,酶切和测序鉴定后,重组表达质粒转入表达菌Rosetta,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况。利用Ni-NTA柱亲和层析纯化蛋白,测定蛋白浓度,SDS-PAGE分析蛋白纯化效果,利用感染DuCV鸭的阳性血清Western blot检测纯化蛋白,并进一步将纯化的蛋白免疫新西兰家兔,制备多克隆抗体。结果表明：成功融合扩增出774 bp的CapY108基因片段,构建重组表达质粒pET32-CapY108,经菌落PCR、酶切和测序鉴定正确后,导入Rosetta菌中,重组Cap蛋白以包涵体的表达形式存在,大小约为50 KD,与预期大小一致。纯化后的重组蛋白条带较清晰,浓度约为0.289 mg/mL, Western blot检测表明,表达蛋白为Cap蛋白,并且成功纯化。进一步将纯化的Cap蛋白免疫新西兰家兔后,ELISA检测抗体效价1：80000以上,Western blot利用制备多克隆抗体检测出Cap蛋白条带,成功制备出其多克隆抗体,为后续研究提供了试验素材。2.酵母双杂交诱饵载体的构建将密码子优化后的Cap基因构建至酵母双杂交质粒pGBKT7中,构建重组质粒pGBKT7-Cap,菌落PCR及酶切鉴定正确后,转化酵母菌株Y2HGold感受态,利用Western blot检测诱饵蛋白是否表达,同时检测诱饵蛋白对酵母细胞有无毒性以及是否有自激活现象。结果表明,成功构建诱饵载体pGBKT7-Cap,质粒转入酵母细胞后能够表达,大小50 KD左右,同时诱饵蛋白对其无毒性,且没有自激活现象。为下一步利用酵母双杂交技术筛选与其有相互作用的蛋白奠定了基础。3.酵母双杂交文库的构建提取感染DuCV后鸭脾脏的总RNA,将RNA反转录合成第一链cDNA,经LD-PCR扩增得到双链cDNA,纯化后,与pGADT7-Rec载体共同转化至酵母菌Y187中,涂至SD/-Leu平板,5d后收菌,检测文库质量。结果表明：构建cDNA文库滴度为1.6×107cfu/mL,转化效率为1.29×106/4.64μg,扩增后文库滴度为3.7×108cfu/mL,随机挑取22个克隆质粒,PCR鉴定显示,其插入片段长度在500-3500 bp,随机挑取15个克隆质粒测序鉴定,重组率为93.3%。结果表明,该文库构建成功,可进一步利用其筛选与Cap蛋白相关的宿主蛋白。4.与Cap蛋白互作蛋白的筛选为筛选与Cap蛋白有相互作用的宿主蛋白,利用酵母双杂交Cap诱饵与感染DuCV后鸭脾脏的cDNA文库杂交,涂至TDO平板,3 d后挑取大的白色菌落,划线至QDO/X/A,传代3次,以期筛选出互作蛋白,并进一步从筛选的阳性酵母菌中提取质粒,测序鉴定,挑取未移码的文库质粒与pGBKT7-Cap质粒,共转至酵母菌Y2HGold,涂至平板QDO/X/A,进一步验证其相互作用。实验结果显示：成功筛选出一个未移码的全长鸭mRNA,精脒/精胺N1-乙酰转移酶1(spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1, SAT1),经共转染酵母菌Y2HGold验证,表明该基因表达的蛋白能与Cap蛋白相互作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

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本文编号：2319956