四种鹅球虫18S与ITS rDNA序列的克隆及系统发育分析

发布时间：2018-11-14 07:22

【摘要】：鹅球虫是一类寄生于家鹅及雁形目(Anseriformes)鸟类的消化道或肾脏细胞的寄生性原虫,在分类上隶属复顶亚门(Apicocomplexa)、孢子虫纲(Sporozoa)、真球虫目(Eumeriina)、艾美耳科(Eimeriidae),呈世界性分布。鹅球虫种类众多,临床上多为混合感染,传统分类方法鉴别难度较大。本研究采用单卵囊分离方法建立了鹅艾美耳球虫(Eimeria anseris)、赫尔曼艾美耳球虫(E. hermani)、多斑艾美耳球虫(E. stigmosa)和金黄艾美耳球虫(E.fulva)等4种鹅球虫纯种株,对其18S rDNA及ITS rDNA序列进行了克隆与序列分析,并分析了鹅球虫与其他动物球虫间的系统发育关系,旨在分子水平对鹅球虫作进一步鉴别分析,为鹅球虫的分子鉴别诊断和分子流行病学调查奠定基础。1、扬州地区鹅球虫的流行病学调查采用形态学分类方法,对扬州的高邮、江都、邗江、仪征、宝应等不同地区的63个鹅群进行鹅球虫检查,感染球虫的鹅群为57个,感染率为90.47%；3周龄以内鹅群的球虫感染率最低,感染率为66.66%,3-9周龄球虫感染率最高,感染率为100%。不同地区鹅群均检测到有较高的球虫感染率,其中邗江、仪征、宝应3地的鹅群球虫感染率均高达100.00%。鹅球虫多为混合感染,混合感染率为85.96%。共检到1科2属6种球虫,其中艾美耳属(Eimeria) 5种：鹅艾美耳球虫(E. anseris)、赫尔曼艾美耳球虫(E. hermani)、金黄艾美耳球虫(E.fulva)、有毒艾美耳球虫(E. nocens)、多斑艾美耳球虫(E. stigmosa);泰泽属(Tyzzeria)1种：稍小泰泽球虫(T. parvula);其中稍小泰泽球虫和赫尔曼艾美耳球虫为优势种,其感染率分别为74.60%和65.08%。2、四种鹅球虫的分离鉴别与纯种株的建立采用单卵囊分离技术,获得了4株纯种鹅球虫,并鉴定为鹅艾美耳球虫、赫尔曼艾美耳球虫、多斑艾美耳球虫与金黄艾美耳球虫。主要鉴定指标如下：鹅艾美耳球虫：潜在期6d左右,幼鹅临床症状明显,部分幼鹅死亡。卵囊呈梨形,前端异常狭窄,卵囊壁为单层结构,无色,厚度约1μm,囊壁光滑,有卵膜孔,无极帽,孢子囊为卵圆形,有孢子囊残体,卵囊大小为(18.5-22.7) μm×(14.1-19.3)μm。赫尔曼艾美耳球虫：潜在期4 d左右,幼鹅临床症状不明显。卵囊呈卵圆形,卵囊壁为双层结构,无色,较厚,囊壁光滑,有卵膜孔,无极帽,孢子囊为卵圆形,斯氏体不明显,卵囊大小为(24.0～27.6)μum×(17.5～19.5)多斑艾美耳球虫：潜在期4.5 d左右,幼鹅临床症状不明显。卵囊呈宽卵圆形,黄褐色,卵囊壁厚度为1.2-2.0μm,两端比侧面厚,囊壁表面有斑点,有卵膜孔,无极帽,孢子囊为卵圆形,孢子囊残体为细小的颗粒,卵囊大小为(19.7～23.3)μm×(14.1～19.3)μmo金黄艾美耳球虫：潜在期7d左右,幼鹅临床症状较明显,无幼鹅死亡。卵囊呈宽卵圆形,黄褐色,卵囊壁为双层,外层有交叉的条纹,孢子化卵囊的窄端有一个大的折光颗粒,孢子囊有斯氏体,每个孢子囊含有粗大颗粒状的残体,有卵膜孔,无极帽,孢子囊残体为细小的颗粒,卵囊大小为(25.6～32.4)μm×(20.2～25.2)3、四种鹅球虫188区序列的克隆与序列分析在分析了多种艾美耳球虫18SrDNA序列的基础上,设计一对艾美耳属球虫的通用引物,分别对鹅艾美耳球虫、赫尔曼艾美耳球虫、多斑艾美耳球虫、金黄艾美耳球虫18S rDNA部分序列进行PCR扩增、克隆和测序,并用DNAstar软件对这4种鹅球虫与15种艾美耳球虫的18S rDNA序列进行同源性分析,最后以火鸡组织滴虫为外类群,采用邻接法构建了4种鹅球虫与29种艾美耳亚目原虫的18S rDNA序列系统进化树。结果显示,鹅艾美耳球虫、赫尔曼艾美耳球虫、多斑艾美耳球虫和金黄艾美耳球虫的18S rDNA部分序列长度分别为1695 bp、1696 bp、1703 bp、1694 bp虫种间的相似性以4种鹅球虫最高,其次为鹅球虫与鹤源艾美耳球虫。在系统发育树中,艾美耳属球虫与成囊类球虫各形成一个单系分支；锦鲤的艾美耳球虫与其他动物的艾美耳球虫形成姊妹群关系；湿地鸟类的艾美耳球虫聚合为一分支,鸡形目和哺乳类动物的艾美耳球虫形成另一分支。本研究为利用18SrDNA序列来鉴定鹅球虫种类奠定了理论基础。4、四种鹅球虫ITS区序列的克隆与序列分析用一对艾美耳属球虫ITS rDNA序列的通用引物,分别对鹅艾美耳球虫、赫尔曼艾美耳球虫、多斑艾美耳球虫、金黄艾美耳球虫ITS rDNA序列进行PCR扩增、克隆和测序,并用DNAstar软件对这4种鹅球虫的ITS rDNA序列进行同源性分析,最后以火鸡组织滴虫为外类群,采用最大简约法分别构建4种鹅球虫的ITS全序列进化树以及与其它多种不同艾美耳亚目原虫的ITS全序列、ITS-1序列、ITS-2序列的系统进化树。结果显示,鹅艾美耳球虫、赫尔曼艾美耳球虫、多斑艾美耳球虫和金黄艾美耳球虫的ITS rDNA序列长度分别为1051 bp、1000 bp、926bp、1073bp。4种鹅球虫5.8S序列相似性最高,ITS-1序列相似性最低,ITS全序列及ITS-2序列相似性相近。从4种鹅球虫的ITS全序列进化树来看,形态学具有一定相似性的鹅球虫同样表现出在进化关系上的亲近性,而其它三个进化树并不能很好的描述不同动物源球虫之间的进化关系。本研究显示ITS rDNA序列适用于鹅球虫的分类鉴定及种下进化分析。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.7

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本文编号：2330451