超高效液相色谱—串联质谱法用于蛋鸡血浆中利巴韦林代谢规律研究

发布时间：2018-11-18 15:13

【摘要】：我国是禽产品消费大国,禽产品质量安全时常面临兽药残留、病原微生物污染的风险。在"速生鸡"事件中,养殖户违规使用金刚烷胺、利巴韦林等人用抗病毒药物,引起消费者极大关注,同时也暴露出兽药残留对禽产品质量安全的影响。由于利巴韦林在鸡体内的相关基础性研究尚属空白,面对违禁使用的客观事实,尚不能对此实施有效的监管。本研究以蛋鸡为研究对象,建立了超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法检测血浆中的利巴韦林及主要代谢产物1H-1,2,4-三氮-3-甲酰胺(TCONH_2)、1-β-D-呋喃基核糖-三氮唑-3-羧酸(RTCOOH),并对利巴韦林在蛋鸡体内的药代动力学进行了研究,同时对利巴韦林在肝微粒体体内代谢进行初步探索。1.蛋鸡血浆中利巴韦林及主要代谢产物检测方法的建立建立了同时检测血浆中利巴韦林及其主要代谢物TCONH_2和RTCOOH的超高效液相色谱-串联质谱分析方法。以~(13)C_5-利巴韦林为内标,鸡血浆样品加入适量甲醇沉淀蛋白,前处理样品经ZORBAX SB-Aq(3.0 mm×100mm,1.8μm)色谱柱分离,以0.1%甲酸水和甲醇为流动相,梯度洗脱分离,采用正离子多反应监测模式(MRM),内标校准曲线定量。结果表明:利巴韦林、TCONH_2、RTCOOH线性范围分别为5～5000ng/mL、5～5000ng/mL、50～5000ng/mL,相关系数 r2分别为 0.9947、0.9992、0.9976。高、中、低三个浓度(1000、100、10 ng/mL)质控样品的添加回收率,均在84.1%～108.2%之间,批内相对标准偏差1.6%～13.4%(n=6),批间相对标准偏差3.8%～16.9%(n=12)。利巴韦林、TCONH_2、RTCOOH在血浆样品中的的检出限分别为2、2、10ng/mL,定量限为5、5、20 ng/mL。该方法快速省时,有效地排除了内源性干扰,分离了利巴韦林、TCONH_2、RTCOOH,并采用MRM模式测定,定性准确。本方法线性范围宽,重复性好,适用于血浆样品中利巴韦林及主要代谢产物的测定。2.利巴韦林在蛋鸡体内代谢规律初步研究京红蛋鸡单剂量口服灌喂利巴韦林30mg/kg BW,采集给药后不同时间点的静脉血,以超高效液相色谱-串联质谱法测定血浆中利巴韦林浓度。结果显示,给药后血浆中利巴韦林浓度迅速升高,随着代谢消除的进行,血药浓度逐渐下降,24h时血药浓度低于方法检出限。采用非房室药动力学软件WinNonlin 6.3对血药浓度-时间数据进行分析,主要药代动力学参数:药时曲线下面积(AUC_(0-t))、血浆消除半衰期(T_(1/2β))、达峰时间(T_(max))、达峰浓度(C_(max))分别为(10658.18±2627.348)h·ng/mL、(2.9461±0.9010)h、(1.5909±0.7355)h、(2796.54±1120)ng/mL。数据表明,蛋鸡口服给药利巴韦林后吸收迅速,到达峰值时间短,体内分布广,消除速度快。TCONH_2和RTCOOH在蛋鸡血浆中的浓度随着原药的吸收代谢,呈现先升高后下降趋势,24h后均低于检出限,呈现出稳定的生成和消除过程。利巴韦林在血浆中的代谢产物以RTCOOH为主,约占70%,且RTCOOH在两种代谢物中所占比例随时间进行呈缓慢下降趋势,最终稳定在75%。3.利巴韦林在鸡肝微粒体中体外模拟代谢研究采集空白蛋鸡肝脏组织,并用差速离心法制备肝微粒体,研究肝微粒体蛋白浓度、体外孵育时间和孵育条件对利巴韦林代谢消除的影响,并采用线性离子阱质谱对代谢产物进行分析。结果显示,利巴韦林不与肝微粒体反应,孵育样品中无TCONH_2和RTCOOH,经线性离子阱质谱扫描,没有发现未知代谢产物。由此可以认定,利巴韦林不受肝微粒体CYP 450酶的代谢作用。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S859.7;O657.63

【参考文献】