禽白血病病毒衣壳蛋白与囊膜蛋白单克隆抗体制备及诊断试剂盒研制

发布时间：2018-11-27 15:03

【摘要】：禽白血病是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)引起的鸡的肿瘤性疾病。它可以使鸡直接发病,产生肿瘤而死亡;也可以导致感染鸡产生免疫抑制,继发多种病原的混合感染,使病鸡对疫苗的免疫应答能力下降,严重影响鸡的生产性能。2008年以来,禽白血病尤其是J亚群禽白血病在我国大部分省份不同程度的爆发给我国养禽业造成了很大的经济损失。禽白血病目前没有有效的防治措施。预防本病的主要方法是淘汰阳性鸡,净化种群。因此利用群特异性或亚群特异性单克隆抗体(Monoclonal Antibody,MAb)建立ALV抗原诊断方法对于临床上ALV的诊断净化、防控、流行病学监测等具有重要意义。p27蛋白作为ALV的群特异性抗原,因其序列高度保守并且含有许多易于被检测的抗原位点而成为制备检测抗体的首选抗原。本研究首先对p27蛋白进行原核表达与纯化,利用杂交瘤技术制备了针对p27蛋白的4株MAb,分别命名为3A9、2E5、3D5、3H12。然后利用肽扫描(Pepscan)技术对p27蛋白的表位信息进行分析,得到一个线性p27蛋白表位181PPSAR185,该表位在ALV各个亚群之间高度保守,是群特异性表位。以制备的MAb 2E5作为捕获抗体,MAb 3D5作为检测抗体建立了禽白血病病毒群特异性抗原ELISA检测方法。通过对各项反应条件的优化,确立了该方法的最佳程序。该方法特异性好,可与家禽常见的A、B和J亚群ALV反应,但不与其他禽病病原如NDV、IBDV、MDV、AIV等反应。该方法对重组p27蛋白的最低检测量为1.25ng/m L,敏感性略高于美国IDEXX Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit(ALV Ag)试剂盒。重复性实验表明,同一样品的批内和批间变异系数均小于10%。保存期实验表明,该试剂盒在4℃保存一年后对阴阳性样品的检测结果仍然具有良好的稳定性。临床样品检测结果显示,本实验研制的试剂盒与美国IDEXX试剂盒对2555份泄殖腔拭子检测结果的总符合率为96.32%;对1141份蛋清样品检测结果的总符合率为97.20%。人工感染实验表明,PCR检测方法最早检出阳性结果为攻毒后11日,本实验研制的ELISA检测试剂盒最早检出阳性结果为攻毒后12日。gp85蛋白在ALV各亚群之间具有高度的变异性,同源性很低,约为30%,具有亚群特异性。本研究首先对gp85蛋白进行原核表达与纯化,制备了针对这个蛋白的MAb,命名为4A3。MAb 4A3不能与ALV-A和ALV-B反应,但是能够与不同国家、时间、地域分离的ALV-J毒株发生特异性反应。然后利用肽扫描(Pepscan)技术鉴定出gp85蛋白的一个线性表位134AEAELRDFI142,该表位在不同的ALV-J毒株之间高度保守,是亚群特异性表位。针对gp85蛋白的MAb和表位的研究为接下来建立以MAb为基础的J亚群ALV抗原诊断方法奠定了良好的基础。本研究共得到4株抗p27蛋白和1株抗ALV-J gp85蛋白的MAbs,鉴定出1个p27蛋白抗原表位和1个gp85蛋白抗原表位,为进一步研究蛋白结构和功能提供了有利的工具。利用MAb 2E5和3D5建立了禽白血病病毒群特异性抗原ELISA检测方法,该方法特异性好、敏感性高、与其它检测方法符合率高,可用于临床中禽白血病病毒的诊断、检测和种群净化。
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【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S855.3

【参考文献】