鸽毛滴虫粘附蛋白AP65的克

发布时间：2018-12-08 08:44

【摘要】：鸽源禽毛滴虫,简称鸽毛滴虫,是一种侵害鸽消化道上段的鞭毛原虫,从而引起鸽毛滴虫病,亦称为“鸽癀”。鸽毛滴虫可感染所有品种和月龄的鸽子,其中对幼鸽危害最大。鸽毛滴虫病的特征是在鸽口腔、食道、嗉囊、前胃出现坏死性溃疡,常造成患鸽呼吸道和上消化道梗阻,妨碍正常呼吸和进食,继而引发呼吸困难和饥饿,严重时造成宿主死亡。鸽毛滴虫病是一种全球性疾病,具有高发性和广泛流行性。药物治疗鸽毛滴虫病有副作用,而且易产生抗药虫株。目前,亟需寻找安全有效的治疗方法,而致病机制相关分子的研究就成为未来重要的研究方向,具有重要意义。对粘膜微生物致病菌而言,粘附宿主细胞是至关重要的过程。只有粘附于宿主细胞,才能进行物理损伤、侵袭等一系列致病过程。粘附蛋白AP65是一种重要的滴虫毒力基因,在多种粘附蛋白中有突出的作用。鸽毛滴虫作为一种粘膜寄生虫,粘附作用可能是其重要特性,AP65也可能是其重要粘附蛋白。鸽毛滴虫潜在的表面毒力因子的探究,将为鸽毛滴虫致病机制和基因工程疫苗的研究奠定分子基础,为有效防止鸽毛滴虫病提供理论依据。本试验具体分为以下4部分:1.鸽毛滴虫AP65序列的克隆测序本研究根据已知的阴道毛滴虫AP65三个基因型序列设计引物,克隆获得鸽毛滴虫AP65部分序列,结合5’RACE PCR和3’RACE PCR获取鸽毛滴虫AP65两端未知序列。通过试验和拼接分析获得两个基因型TgAP65-1(1766bp)、TgAP65-2(1759bp),ORF长1704bp,编码567个AA,上传至GenBank获得序列号KJ721787、KJ721788。2.鸽毛滴虫AP65的序列分析对两个基因型进行序列比对发现,两者核酸同源性为94.22%,AA同源性达95.6%,并且差异主要存在于5’端。同时,对鸽毛滴虫AP65和阴道毛滴虫AP65各基因型的同源性进行了分析,同源性可达90.0%左右,同阴道毛滴虫苹果酸脱氢酶和氢化酶体苹果酸酶高同源(80%)。鸽毛滴虫TgAP65-1、TgAP65-2分别编码一个大小为63057.81Da、63042.74Da的蛋白质,pI分别为8.15、8.48。通过生物信息学软件对氨基酸序列进行分析预测,并结合已知阴道毛滴虫AP65结构功能信息比较,我们发现鸽毛滴虫AP65有短信号肽、无GPI、多个蛋白结合位点、两个苹果酸酶域,分别位于88-278,280-533位置。3.鸽毛滴虫TgAP65-2重组蛋白多克隆抗体的制备构建重组质粒pPIC9.0k-TgAP65-2,并采用氯化锂转染法将重组质粒转入毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达,并用Ni柱纯化。经Western-blot鉴定表达的重组蛋白大小约为65KDa,与理论值相符。将纯化后的重组鸽毛滴虫AP65蛋白三次免疫BALB/c小鼠进行多克隆抗体的制备。通过间接ELISA方法测定抗鸽毛滴虫AP65抗体的效价后,将分离的小鼠血清作为多克隆抗体使用。4.鸽毛滴虫自然表达AP65的鉴定及虫体表面定位裂解虫体进行SDS-PAGE和Western-blot对鸽毛滴虫自然表达的AP65进行鉴定,结果显示AP65为虫体蛋白。通过间接免疫荧光检测试验对虫体自然表达的AP65进行虫体表面定位,荧光显微镜下可见虫体表面及鞭毛上都有荧光,但荧光较弱。
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【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.7

【参考文献】