副结核分枝杆菌34kD蛋白在牛副结核ELISA检测中的应用研究

发布时间：2018-12-14 07:16

【摘要】：牛副结核病又称副结核性肠炎是以反刍动物为主同时也是人畜共患病,是由副结核分支杆菌(Mycobacterium avium subsp Paratuberculosis,MAP)引起长期的、慢性的、顽固性的、消耗性的一种传染病。1891年由Johne率先发现并且描述该病,所以我们把该病又称约内氏病(Johne’s disease),OIE将其列为B类疫病,该病能引起动物增生性肠炎,即将MP热灭活或致弱后制成疫苗,然后免疫接种牛还有羊,可以降低病牛早期出现间接性腹泻,能导致病畜产生顽固性腹泻,潜伏期数月至一两年。粪便非常的稀薄,并伴有恶臭的气味,腹泻常呈喷射状态排出,粪便带有气泡和黏液,最终导致的结果是死亡。还可以通过有病的牛羊传染给人以及其他动物,本病能在全球范围内非常广泛的流行,目前并没有有效的治疗办法,只能做到预防为主,可以从疫病的传播途径做到预防,并且日常的饲养管理需要提高,来增加动物的自身抵抗力。最主要是对牛群做彻底的检疫工作,用PPD检测法,对检测出的病牛做第二次检测,一旦确定患病一定要进行隔离并做出适当的淘汰和捕杀。有的国家为了控制副结核病的传播与蔓延,会给牛群做疫苗的接种,来减少此病的发生,这种方法也是存在很大的弊端,影响血清学检测和变态反应检测,接种疫苗后会使健康的无病的动物血清转为阳性,同时在疫苗的注射部位会有肉芽肿的产生,这样就会影响牛副结核病的变态反应检测结果。因为接种疫苗后影响了对牛的正常检疫工作,所以,有很多国家已经规定不允许给牲畜接种疫苗,怕妨碍牲畜的进出口贸易。副结核病被认为是给养牛行业带来经济的损失最最重要的因素,尤其是对养牛行业和奶制品行业造成了严重的经济损失,可见,迫切需要开发新型、安全、高效抗副结核分枝杆菌的疫苗以及特异性非常良好的诊断抗原试剂已经迫在眉睫。本研究利用大肠杆菌表达系统获得副结核分枝杆菌34kD抗原,用该菌株表达的34kD蛋白作为牛副结核病诊断抗原或者是亚单位疫苗。以副结核染色体DNA基因组为模板,以特异性引物对其进行PCR扩增,以凝胶回收试剂盒纯化PCR产物,进而克隆至JM109中,构建重组克隆质粒pMD-18T-34。通过蓝白斑、质粒大小、酶切分析及PCR筛选、鉴定重组质粒,并进行序列分析。重组质粒pMD-18T-34及表达载体pET28a均以BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切,切胶回收纯化后,以T4 DNA Lingase于16℃连接2 h,4℃过夜,构建重组表达质粒pET28a-34,并转化至感受态E.coli DH5α中,筛选、鉴定重组表达质粒。将重组表达质粒转化至E.coli BL-21中,经IPTG诱导后,用SDS-PAGE和Western blotting检测目的基因在E.coli BL-21中的表达。将获得纯化后的34kD基因,对牛场采集的血液进行牛的副结核病检测,首先要确定抗原的包被浓度和血清的最佳稀释倍数,通过间接ELISA实验的方法测得的OD492之P/N比值,P/N比值最大者为11.888,即重组蛋白的最适包被浓度为0.6μg/mL,血清样本的最佳稀释倍数为1∶400进行检测,用34kD抗原对比对359份牛血清进行检测,PPD检出阳性血清28份,抗原34kD检出阳性血清23份,34kD检出阴性血清326份,PPD检出阴性血清321份,其中阳性的符合率为82.14%。阴性的符合率为98.46%,因此本课题的研究成果不仅在副结核病的诊断方面具有重要的应用价值,而且对开发副结核病新型的疫苗具有重要意义。
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【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.618

【参考文献】