凝结芽孢杆菌的筛选及高密度培养工艺研究

发布时间：2018-12-14 20:20

【摘要】：本研究从生态养殖场健康仔猪盲肠及粪便样品中筛选凝结芽孢杆菌,并对菌株的益生特性及安全性进行研究,最终获得益生性能良好且无毒、无抗生素抗性的凝结芽孢杆菌BC303;通过阶段控制策略实现了该菌体的高密度培养与快速芽孢化,并借助转录组测序对BC303芽孢化形成过程的关键节点进行研究,初步构建了BC303的芽孢化起始途径及相关调控模型。主要研究结果如下:1、从生态养殖场健康仔猪盲肠及粪便样品中筛选得到40余株芽孢杆菌,经形态学、生理生化分析及16S rDNA鉴定,获得4株凝结芽孢杆菌,分别命名为BC147、BC235、BC310和BC303。四株菌均具有良好粘附能力,并对胆盐和低酸环境表现出较强的耐受能力,其中BC303对仔猪肠黏液的黏附率高达41.67%,在pH 4的条件下其营养细胞存活率高达91.0%,在0.3%胆盐中暴露2小时,其存活率仍维持在40%以上。病原菌拮抗试验发现,四株菌对常见肠道病原菌均表现出良好的抑菌作用,其中对Salmonella typhimurium ATCC 13311高度抑制;同时,四株菌均具有良好的蛋白酶和纤维素酶产生能力,且对不同种类的兽用抗生素均具有不同程度的敏感,其中BC303对所测试抗生素均高度敏感。将BC303作为候选益生菌进行小鼠饲喂试验,结果表明,该菌株具有良好的安全性,且能提高小鼠的饲料转化率、免疫能力和日增重。2、以候选益生菌BC303为研究对象,通过单因素试验和响应面法优化对其发酵条件和发酵培养基配方进行研究,最终确定其最佳培养条件为时间20h,初始pH8.0,培养温度37℃,转速230rpm,接种量3%;发酵培养基各组分最佳配比:葡萄糖15.80g/L,蛋白胨15.90g/L,酵母粉11g/L,MgSO4 4.60g/L。以8h添加15g/L葡萄糖为最佳补糖方案,可使BC303的营养细胞密度升高至2.13×1010CFU/mL;在此基础上,以16h添加1.8g碳酸钙+1g麸皮+0.1mg异亮氨酸为最佳促孢方案,可使其芽孢量达到1.3×108CFU/mL;对产孢阶段的发酵条件进行研究发现,40℃、280rpm为其最优产孢条件。通过促孢因子的筛选、添加及产孢阶段发酵条件的优化,BC303孢子量提高至8.4×108CFU/mL。3、通过原核链特异性转录组测序对凝结芽孢杆菌BC303芽孢化关键节点进行研究,初步构建了其芽孢化起始通路及相关调控模型。BC303芽孢化可能以组氨酸蛋白激酶KinC、KinE的自我磷酸化为起点,随后将磷酸传递给磷酸传递蛋白Spo0F及Spo0B,最终实现产孢转录因子Spo0A的磷酸化而导致孢子的产生;同时,KinC自我磷酸化后亦可能绕过Spo0F、Spo0B,直接将磷酸基团传递给Spo0A使其活化而启动芽孢化过程,在该过程中Spo0A的活性受菌体密度、DNA损伤、氧化还原状态、营养条件及去磷酸化作用等因素的影响。其中Opp、AIP、dnaA、LexA可间接调控组氨酸蛋白激酶的自我磷酸化水平;sda、codY-GTP直接抑制组氨酸蛋白激酶的自我磷酸化;Spo0A-PO4易受到Spo0E的去磷酸化作用。上述调控方式最终将导致Spo0A的表达量以及磷酸化水平的变化,可能对凝结芽孢杆菌孢子启动和形成过程进行调节。
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【学位授予单位】：河南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S816.3

【参考文献】