共表达GFP和猪EGF重组嗜酸乳杆菌的构建及其生物学特性研究

发布时间：2018-12-18 11:13

【摘要】：本研究旨在利用p SET4s,通过基因同源重组技术,将外源基因猪表皮生长因子(EGF)和绿色荧光蛋白(GFP)整合到到嗜酸乳杆菌基因组中,通过抗性筛选与鉴定,获得能够稳定表达GFP和猪EGF的重组嗜酸乳杆菌,并对其进行生物学特性研究。试验一:p SET4s用于嗜酸乳杆菌基因重组可行性的分析(1)p S ET4s电转化条件的优化试验表明,嗜酸乳杆菌培养过夜至OD6 0 0为0.6和终浓度为1.0%的甘氨酸L B培养基均有利于提高p S E T 4 s质粒在嗜酸乳杆菌中转化效率。(2)p S ET4s用于嗜酸乳杆菌基因重组可行性分析通过平板计数的方法对转入到嗜酸乳杆菌中的p S ET4s进行2 8℃稳定性和3 7℃丢失率的分析,结果发现其在2 8℃条件下能够稳定存在;在37℃时,培养16 h后质粒完全丢失。因此p S ET4s穿梭载体用于嗜酸乳杆菌的基因重组是可行的。试验二:共表达GFP和猪EGF重组嗜酸乳杆菌的构建通过PC R扩增获得嗜酸乳杆菌基因组中诱导表达位点和强启动子表达位点的上游同源臂P1、P3和下游同源臂P2、P 4片段,将拼接正确的EGF基因和GFP基因与上下游同源臂及线性化的载体p SET4s进行连接,对重组质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定,并命名p SET4s-P 1-EGF+GFP-P2和p SET4s-P 3-EGF+GFP-P4。将重组质粒分别电转化到嗜酸乳杆菌MG6243中,通过抗性和温度双重筛选得到重组嗜酸乳杆菌,并通过PC R方法对重组嗜酸乳杆菌进行鉴定,并命名为ΔM G6243-1和ΔMG6243-2。试验三:重组嗜酸乳杆菌生物学特性研究(1)GFP和EGF在重组嗜酸乳杆菌的表达提取蛋白后,分别进行考马斯亮蓝染色和Western bl ot分析,结果表明重组菌具有分子量大小与理论相符的明显的差异蛋白条带,荧光显微镜观察重组菌具有绿色荧光;elisa检测发现,重组菌能够稳定表达egf,且浓度可以达到3.1ng/ml;表明表达gfp和egf基因的重组嗜酸乳杆菌构建成功。(2)重组嗜酸乳杆菌的遗传稳定性分析传代10代后的重组菌仍然能扩增出目的基因条带和检测到绿色荧光,说明gfp基因能够在所构建的重组菌中稳定遗传。(3)重组嗜酸乳杆菌的生长特性、酸碱盐的耐受性的研究通过平板计数的方法对重组菌的生长特性、酸碱盐的耐受性进行了研究,结果表明嗜酸乳杆菌与两株重组嗜酸乳杆菌相比,生长特性没有明显的变化,也都表现出一定的耐酸能力和胆盐耐受性。试验四:重组嗜酸乳杆菌对小鼠肠道作用的研究(1)选取6-8周龄体重约20g的雌性昆明小鼠,进行灌服试验,结果显示:与对照组相比,灌服嗜酸乳杆菌菌液降低了小鼠回肠隐窝深度(p0.05),提高了回肠绒毛高度/隐窝深度比值(p0.05);与对照组相比,灌服Δmg6243-1和诱导表达的Δmg6243-1菌液均提高了小鼠十二指肠绒毛高度(p0.05),降低了十二指肠和回肠隐窝深度(p0.05),提高了十二指肠和回肠绒毛高度/隐窝深度比值(p0.05),而灌服诱导表达的Δmg6243-1菌液还显著提高了回肠绒毛高度(p0.05);灌服Δmg6243-2菌液提高了小鼠十二指肠和空肠绒毛高度(p0.05),显著降低了小鼠十二指肠和回肠隐窝深度(p0.05),并且显著提高了十二指肠和回肠绒毛高度/隐窝深度比值(p0.05)。(2)试验选取6-8周龄体重约20g的雌性昆明小鼠,研究重组菌对小鼠小肠的修复作用。结果显示:lps刺激导致了小鼠十二指肠和空肠绒毛高度降低(p0.05),同时降低了十二指肠、空肠和回肠绒毛高度/隐窝深度比值(p0.05)。与lps组相比,灌服嗜酸乳杆菌菌液提高了回肠绒毛高度/隐窝深度比值(P0.05);与LP S组相比,ΔMG6243-1组十二指肠和回肠绒毛高度/隐窝深度比值升高(P0.05);灌服诱导表达的ΔMG6243-1菌液显著提高了十二指肠、空肠和回肠绒毛高度以及绒毛高度/隐窝深度比值(P0.05);与LP S组相比,灌服ΔMG6243-2菌液后,提高了空肠绒毛高度和十二指肠回肠绒毛高度/隐窝深度比值(P0.05),显著降低了回肠隐窝深度(P0.05)。结论:成功构建了稳定表达GFP和EGF的重组嗜酸乳杆菌;重组嗜酸乳杆菌和嗜酸乳杆菌的生长特性没有显著差异;在p H 2.0、p H 2.5、p H 4.0和胆盐浓度分别为0.2%、0.5%、0.8%时,三株菌的耐受性无显著差异,但在p H 3.0和胆盐浓度为1.0%的条件下,重组嗜酸乳杆菌ΔMG6243-2的耐酸性和耐胆盐能力都比重组嗜酸乳杆菌ΔMG6243-1和嗜酸乳杆菌要低;重组嗜酸乳杆菌能维持小鼠肠道健康,并在一定程度上改善了LPS刺激小鼠小肠黏膜形态结构。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：武汉轻工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S816

【参考文献】

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本文编号：2385759