miR-21a-5p对PHEV复制的影响及其作用机制研究

发布时间：2018-12-19 20:38

【摘要】：猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)属于β冠状病毒属的成员,具有典型的嗜神经特性。PHEV主要感染仔猪,尤其是3周龄以内的仔猪,临床表现为呕吐、衰竭、腹泻以及明显的神经症状,死亡率为20%-100%。目前针对该病还未见有效的预防及治疗措施,一旦爆发将对养猪业造成巨大的经济损失。由于该病毒主要侵害神经系统,但其所致神经损伤的机制目前还不清楚,所以从病毒感染与宿主蛋白互作角度开展PHEV的致病机制研究具有重要的科学意义。micro RNAs(mi RNAs)是广泛存在于各种真核生物中的长度约为22nt的单链非编码小RNA,在许多生物学和疾病发生发展过程中起重要的调控作用。例如,mi RNA在Ⅰ型单纯胞疹病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒等感染过程中通过调控靶基因表达而影响病毒在宿主细胞的复制增殖及释放等过程。前期利用基因芯片检测发现,PHEV感染宿主过程中脑组织mi RN A表达谱发生巨大的变化,推测这些差异表达的宿主mi RNA可能在该病毒感染过程中起重要作用,这为深入研究PHEV的致病机制提供了新的思路。本实验选择研究背景较为明确的mi R-21a-5p为研究对象,利用荧光定量PCR方法对PHEV感染宿主过程中mi R-21a-5p的表达变化进行检测。结果显示,与对照组相比mi R-21a-5p表达量明显上调,推测其可能参与PHEV感染宿主的调控过程。进而将化学合成的mi R-21a-5p模拟体或者抑制剂分别转染N2a细胞再接种PHEV,利用荧光定量PCR方法检测PHEV基因组RNA的含量。结果证实,通过有效抑制或者过表达N2a细胞中mi R-21a-5p能使PHEV的复制增殖量减少或者增多。由此可见,在PHEV感染过程中,宿主mi R-21a-5p的上调促进了病毒基因组在细胞内复制。为进一步明确mi R-21a-5p调控PHEV复制的宿主靶点,本研究运用Target Scan、Microcosm Microcosm、Pic Tar三个数据库对mi R-21a-5p的靶基因进行预测和功能分析,发现参与调控突触传递、轴突导向并在维持神经细胞的细胞骨架稳定性相关的支架蛋白Caskin1可能在PHEV所致神经功能损伤中起一定作用。为了确证Caskin1是否为mi R-21a-5p的靶基因,分别构建包含Caskin1 3’UTR靶点及靶点位置碱基突变的双荧光素酶报告载体系统对其进行验证。结果表明,Caskin1为mi R-21a-5p的直接靶点。将mi R-21a-5p模拟体或者抑制剂转染入N2a细胞中,检测Caskin1 m RNA及蛋白表达量。发现模拟体可显著下调其表达量,而抑制剂可上调其表达量,进一步证实Caskin1为mi R-21a-5p的靶基因。为探索mi R-21a-5p是否通过靶向Caskin1来促进PHEV基因组在宿主细胞内复制,利用si RNA使Caskin1在N2a细胞中低表达,然后接种PHEV,检测病毒基因组表达量明显上调,表明mi R-21a-5p可能是通过调控其靶基因Caskin1的表达来促进PHEV基因组在宿主细胞内复制。为了确定mi R-21a-5p在PHEV对小鼠致病过程中的影响,将小鼠脑内分别注射mi R-21a-5p antagomir、mi R-21a-5p antagomir NC、PBS,正常小鼠作为空白对照,接种PHEV后观察小鼠生命体征、体重变化,并在接毒5d后检测小鼠脑内PHEV基因组RNA的含量及Caskin1表达量,结果显示mi R-21a-5p antagomir可有效延缓PHEV感染小鼠的发病时间,并在一定程度上抑制了PHEV在小鼠脑组织的复制,同时小鼠脑组织Caskin1表达量升高,进一步证明了Caskin1为mi R-21a-5p的靶基因。研究结果表明,降低小鼠脑组织中mi R-21a-5p的浓度可减轻PHEV感染的致病过程,且这一过程是通过mi R-21a-5p靶向调控Caskin1的表达进而抑制PHEV基因组复制而实现的。综上所述,PHEV感染宿主过程中mi R-21a-5p表达量上升,其通过靶向抑制Caskin1表达来促进病毒基因组的复制,进而加速了PHEV感染的致病过程。反之,小鼠体内局部降低mi R-21a-5p浓度可一定程度上延缓PHEV感染的发生发展。这些研究成果不仅为mi RNA参与调控PHEV复制提供数据支持,也为深入研究PHEV的致病机制及治疗方案提供新的思路。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

【参考文献】