自噬阻断和溶酶体膜通透化在铅所致大鼠肾小管上皮细胞毒性中的作用

发布时间：2018-12-20 10:17

【摘要】：铅(Pb)是生态环境中的一种常见污染物,一旦进入生物机体便在体内蓄积并对机体产生损伤。铅对机体的损伤呈多系统和多器官性。肾脏是铅损伤的重要靶器官,且近端小管是铅肾脏损伤的靶部位。细胞自噬是一种进化上高度保守、维持细胞内环境稳态的生物学过程,主要通过溶酶体对胞内长寿蛋白,错误折叠蛋白和受损细胞器进行降解并循环利用。研究表明细胞自噬在多种毒物所致肾脏损伤中发挥重要的保护作用,但细胞自噬在铅所致大鼠肾小管上皮(rPT)细胞毒性中的具体机制尚不清楚。溶酶体是细胞自噬降解过程中的关键细胞器。当外界刺激诱发溶酶体膜通透化时,组织蛋白酶B和组织蛋白酶D从溶酶体释放进入胞浆,可激活细胞凋亡途径而发挥其细胞毒性作用。我们前期研究证实细胞凋亡是低剂量铅(0-1.0μM)暴露所致rPT细胞死亡的主要途径,但溶酶体膜通透化是否参与该过程尚未见报道。鉴于溶酶体在细胞自噬与细胞凋亡中的双重调控作用,本研究以原代rPT细胞为研究对象,重点探讨溶酶体功能异常,细胞凋亡与自噬抑制三者之间的关系,为从分子水平揭示铅对肾脏的毒性损伤机理提供理论依据。首先,本研究对铅所致自噬小体蓄积的原因进行了探究。通过蛋白质免疫印迹技术检测铅暴露不同时间(3,6,12 h)自噬标志蛋白LC3-II的表达情况来反映铅对自噬的影响,筛选出自噬现象最明显时的铅暴露时间和剂量进行后续试验。结果表明铅暴露可引起自噬小体的蓄积,在铅浓度为0.5μM,处理时间为12 h时,自噬小体蓄积最明显。采用两种自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA,自噬前期)和氯喹(CQ,自噬后期)干预自噬,通过共聚焦显微技术检测两种自噬抑制剂对铅所致GFP-LC3瞬时转染的rPT细胞中自噬小体数量变化的影响。采用蛋白质免疫印迹技术检测在两种自噬抑制剂存在或不存在情况下对铅所致自噬标志蛋白LC3-II和p62/SQSTM1表达的影响。通过共聚焦显微技术检测铅对RFP-GFP-LC3瞬时转染的rPT细胞中自噬小体向溶酶体转运的影响,进一步确定铅对rPT细胞自噬流的影响。结果表明铅通过抑制自噬引起自噬小体蓄积。其次,我们对自噬流抑制的具体机制进行了研究。采用内源性LC3免疫荧光着色标记自噬小体,LAMP1免疫着色标记溶酶体,通过共聚焦显微技术检测铅暴露对自噬小体和溶酶体融合的影响。使用Lyso-Tracker Red和Acridine Orange两种溶酶体pH探针标记溶酶体,并通过共聚焦显微技术检测铅对rPT细胞溶酶体pH的影响。随后通过蛋白质免疫印迹技术检测铅对调控细胞溶酶体酸性环境的3种V-ATPase蛋白表达的影响。结果表明铅可能通过抑制2种溶酶体V-ATPases表达而升高溶酶体pH。采用共聚焦显微技术和蛋白质免疫印迹技术分别检测铅对DQ-BSA-Green荧光强度和细胞总组织蛋白酶B、D蛋白表达的影响。研究结果表明铅所致自噬阻滞不是由自噬小体与溶酶体融合受阻引起,而是由溶酶体功能受损(包括溶酶体碱化和溶酶体降解能力降低)引起。最后,我们对溶酶体膜通透化与细胞凋亡的联系进行了研究。采用共聚焦显微技术和蛋白质免疫印迹技术分别检测铅对组织蛋白酶B、D亚细胞分布的影响。同时,采用CA 074(组织蛋白酶B抑制剂)和Pep A(组织蛋白酶D抑制剂)分别预处理rPT细胞随后进行铅染毒,通过蛋白质免疫印迹技术、共聚焦显微技术、流式细胞术分别检测CA 074或Pep A与铅共处理对铅处理所致凋亡标志蛋白caspase-3剪切体、DAPI着染的细胞核形态、细胞凋亡率变化的影响。结果表明铅可引起溶酶体膜通透化,导致组织蛋白酶B、D由溶酶体释放进入胞浆,进而启动细胞凋亡。总之,铅暴露所致溶酶体功能受损(溶酶体碱化和溶酶体蛋白水解酶活性降低)导致自噬抑制,自噬流的阻滞导致肾毒性;铅介导的溶酶体膜通透化可导致组织蛋白酶B、D由溶酶体释放进入胞浆进而启动细胞凋亡,引起肾毒性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S859.82

【相似文献】

相关期刊论文 前7条

1 石贞玉;厉永强;;自噬的双重功能[J];黑龙江科技信息;2014年19期

2 朱明月,周鹏;凋亡与自噬性死亡[J];热带农业科学;2005年02期

3 王棋文;王涛;姚路连;王怡;袁燕;顾建红;刘学忠;卞建春;刘宗平;;自噬在镉致大鼠大脑皮质神经细胞损伤中的作用[J];中国兽医学报;2013年09期

4 ;中国科学家确认30多个水稻自噬相关基因[J];生物学教学;2012年04期

5 张微;孙鸿;邢莉萍;卫晓静;王华忠;;小麦自噬相关基因ATG10的克隆及白粉菌侵染诱导的ATG10的表达[J];作物学报;2014年08期

6 朱家桥;王玲玲;程来洋;王棋文;王亨;刘学忠;刘宗平;;镉对体外培养大鼠肝细胞自噬的影响[J];中国兽医学报;2013年12期

7 戴汉川;黄春晓;吕新慧;王宁;伍晓雄;;脂多糖对断奶仔猪胸腺自噬Beclin-1基因的表达分析[J];畜牧与兽医;2012年S1期

相关会议论文 前10条

1 韦雪;漆永梅;张迎梅;;镉、活性氧自由基与自噬发生的分子机制[A];中国活性氧生物学效应学术会议论文集（第一册）[C];2011年

2 秦正红;粱中琴;陶陆阳;黄强;刘春风;蒋星红;倪宏;邢春根;;自噬在细胞生存与死亡中的作用[A];中国药理学会第九次全国会员代表大会暨全国药理学术会议论文集[C];2007年

3 秦正红;;自噬与肿瘤和神经细胞生存——药物作用的新靶位[A];全国生化与分子药理学药物靶点研讨会论文摘要集[C];2008年

4 李芹;丁壮;;自噬功能研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集[C];2013年

5 胡晨;张璇;滕衍斌;胡海汐;周丛照;;家蚕中自噬相关蛋白Atg8的结构研究[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2009年学术交流会论文摘要汇编[C];2009年

6 陈希;李民;Xiao-Ming Yin;李林洁;;通过不同途径诱导自噬的化合物对Atg9的依赖性不同[A];细胞—生命的基础——中国细胞生物学学会2013年全国学术大会·武汉论文摘要集[C];2013年

7 陈涓涓;敬静;蔡元博;张俊龙;;针对活体细胞自噬行为的发光金属配合物的设计[A];中国化学会第28届学术年会第8分会场摘要集[C];2012年

8 宁晓洁;钟自彪;王彦峰;付贞;叶启发;;缺血再灌注诱导小鼠肝细胞自噬[A];2013中国器官移植大会论文汇编[C];2013年

9 吴晓琦;李丹丹;邓蓉;江山;杨芬;冯公侃;朱孝峰;;CaMKKβ磷酸化Beclin 1调控自噬及其在肿瘤治疗中的作用[A];2011医学科学前沿论坛第十二届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2011年

10 周鸿雁;裴中;陈杰;申存周;钱浩;刘妍梅;冼文彪;郑一帆;陈玲;;线粒体动力改变参与了LRRK2突变导致的自噬[A];中华医学会第十三次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2010年

相关重要报纸文章 前3条

1 生命学院;俞立课题组在《科学》发文揭示自噬调控的重要机制[N];新清华;2012年

2 周飞 张粹兰;花榈木“自噬”可抗癌[N];广东科技报;2011年

3 张明永;水稻自噬基因研究取得新进展[N];广东科技报;2011年

相关博士学位论文 前10条

1 贾盛楠;转录因子p8调控自噬的功能研究[D];浙江大学;2015年

2 皮会丰;DNM1L蛋白介导的线粒体自噬在镉致肝脏毒性中的作用研究[D];第三军医大学;2015年

3 李倩;miRNAs介导的自噬抑制在类鼻疽杆菌感染免疫逃逸中的作用机制研究[D];第三军医大学;2015年

4 黎炳护;激活TRPV1诱导自噬在血管平滑肌细胞泡沫化中作用及机制研究[D];第三军医大学;2015年

5 陈江伟;自噬在椎间盘退变中的作用及机制研究[D];上海交通大学;2014年

6 李荣荣;自噬在布比卡因肌毒性中的作用及机制研究[D];南京医科大学;2015年

7 王维;NF-κB信号通路参与介导的自噬在高血压大鼠心血管重构的作用研究[D];山东大学;2015年

8 刘春朋;日粮硒缺乏对鸡肝脏蛋白质组学及自噬变化的影响[D];东北农业大学;2015年

9 梁蓓蓓;P53凋亡刺激蛋白ASPP2调控细胞自噬的研究[D];上海交通大学;2012年

10 袁扬;线粒体自噬的抗缺血性脑损伤作用及其调控机制研究[D];浙江大学;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 匡红;Jnk2通过smARF的降解来调控压力诱导的线粒体自噬及组织损伤[D];浙江理工大学;2015年

2 洪永桃;自噬在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的作用及甲氨蝶呤对自噬的影响[D];川北医学院;2015年

3 李宁;自噬在吗啡心肌保护中的作用及机制研究[D];河北联合大学;2014年

4 刘冰;脑缺血预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注后自噬及凋亡的影响[D];河北联合大学;2014年

5 王存凯;microRNA-30a-5p通过抑制自噬阻止肝星状细胞激活[D];河北医科大学;2015年

6 张宇程;泛素连接酶HOIL-1L在线粒体自噬中的功能与机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2015年

7 唐芙蓉;自噬对奶山羊雄性生殖干细胞生物学特性的影响[D];西北农林科技大学;2015年

8 陈军童;肾损伤分子1对高糖诱导人肾小管上皮细胞自噬作用的影响[D];郑州大学;2015年

9 包勇;Kap1在LBH589诱导的乳腺癌细胞MCF-7自噬形成中的作用[D];复旦大学;2013年

10 魏园玉;P53缺失型HL-60白血病细胞内Nucleostemin下调对mTOR通路介导的自噬活性的影响[D];郑州大学;2015年

，

本文编号：2387851