猪三种细胞因子免疫增强作用和山羊四种抗血清抑制细胞因子活性分析

发布时间：2019-01-06 11:55

【摘要】：细胞因子是由机体免疫细胞和免疫相关细胞分泌的一类高活性多功能蛋白质类物质,是细胞间的信号传递分子,调节和介导着体内的免疫应答和炎症反应,是机体免疫学功能发挥的必要成分。IL-2、IL-4、IL-18和IFN-γ都是机体免疫应答不可缺少的成分,因其具有重要的免疫调节作用而成为免疫佐剂研究的热点。本研究对猪重组IL-2、IL-4和IFN-γ进行了诱导表达,进而开展了对口蹄疫合成肽疫苗免疫增强作用的研究,为细胞因子佐剂的临床应用提供了试验依据;又对山羊重组IL-2、IL-4、IL-18和IFN-γ进行了诱导表达,并进行了各重组蛋白的生物学活性检测和相应抗血清抑制蛋白活性的研究。1.猪重组IL-2、IL-4和IFN-γ原核表达和生物学活性检测对含有 pET28a-IL-2、pET32a-IL-4 和 pET28a-IFN-γ重组质粒的 Rosetta2 阳性克隆菌进行诱导表达,分别表达了相对分子量为21.4kDa、30.3kDa和20.7kDa的重组蛋白,并对包涵体蛋白进行了纯化和复性。通过CCK-8法检测了重组蛋白IL-2和IL-4对猪外周血淋巴细胞的增殖活性,并利用VSV/PK15系统检测了重组蛋白IFN-γ的抗病毒活性。结果显示猪重组蛋白IL-2能显著刺激外周血淋巴的增殖,并表现出一定的剂量依赖性,在蛋白浓度为10μg/mL时刺激效应最强,但当超过10μg/mL时刺激增殖效应开始减弱;重组蛋白IL-4不能有效刺激淋巴细胞的增殖,增殖效应较弱;重组蛋白IFN-γ能有效抑制VSV在PK15细胞上的复制,具有良好的抗病毒作用,其抗VSV 活性为 1.135×1 04U/mg。2.猪重组IL-2、IL-4和IFN-γ对口蹄疫合成肽疫苗的免疫增强作用研究分别将原核表达的猪重组IL-2、IL-4和IFN-γ蛋白以15 μg/kg剂量与口蹄疫合成肽疫苗配伍免疫仔猪,并设空白对照组(PBS)、口蹄疫疫苗对照组、空载体蛋白对照组,检测仔猪抗口蹄疫抗体水平和血清细胞因于IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γ含量的变化,观察其免疫佐剂效应。结果表明:制备的IL-2、IL-4和IFN-γ重组蛋白均有较好的生物学活性,其中IL-2和IFN-γ重组蛋白均能显著提高仔猪抗口蹄疫抗体水平(P0.01),而IL-4重组蛋白抑制口蹄疫抗体的产生(P0.01)。血清细胞因子检测结果发现疫苗+IL-4组的IL-4和IL-10含量均较疫苗对照组显著升高(P0.05),疫苗+IL-2组及疫苗+IFN-γ组的IFN-γ含量较疫苗对照组极显著升高(P0.01)。结果提示,重组细胞因子IL-2和IFN-γ分别作为免疫佐剂与口蹄疫疫苗配伍使用,能显著增强机体的体液和细胞免疫应答。3.山羊重组IL-2、IL-4、IL-18和IFN-γ抗血清抑制重组蛋白活性分析将含 pET32a-IL-2、pET32a-IL-4、pET28a-IL-18 和 pET32a-IFN-γ重组质粒的 BL21阳性克隆菌经IPTG诱导表达,分别表达了相对分子量为35.6 kDa、30.7 kDa、37.3 kDa和22.3 kDa的重组蛋白,并对表达的包涵体蛋白进行了纯化和复性。利用CCK-8法检测了重组蛋白IL-2、IL-4和IL-18对山羊外周血淋巴细胞的增殖活性,通过巨噬细胞吞噬功能和硝酸还原酶法检测了 IL-18对鼠腔来源巨噬细胞TQ噬中性红和分泌NO能力的影响,并利用VSV/PK15系统检测了 IFN-y重组蛋白的抗病毒活性,接着进行相应抗血清抑制上述重组蛋白活性的检测。结果表明山羊重组蛋白IL-2、IL-4和IL-18能显著刺激山羊外周血淋巴细胞的增殖,并表现出一定的剂量依赖性,三种重组蛋白分别在5μg/mL、25μg/mL和4μg/mL时刺激效应最强;IL-18对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红和分泌NO能力的影响也与其剂量密切相关,在适宜的浓度范围内随蛋白剂量增加而能力增强,在IL-18浓度为0.25 μg/mL时巨噬细胞吞噬中性红能力最强,在IL-18浓度为1 μg/mL时分泌NO能力最强。山羊重组IFN-γ具有较好的抗病毒作用,其抗VSV活性为2.52×104U/mg。抗血清封闭试验结果表明相应抗血清能分别抑制上述重组蛋白生物学活性的发挥。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.4

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本文编号：2402754