山羊Grp78基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

发布时间：2019-01-29 00:05

【摘要】：内质网是一种与蛋白质加工和钙离子储存密切相关的重要细胞器,一旦内质网中出现钙稳态失衡,或者发生未折叠蛋白及错误折叠蛋白的累积,都会引起内质网应激,进而通过未折叠蛋白反应通路提高细胞对伤害的抵抗力和适应力。葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein78,GRP78)又被称为BiP/HSPA5是有关内质网功能的中央调节器,它的变化被普遍当做内质网的应激标记,同时也是未折叠蛋白反应的起始反应。根据NCBI中提供的山羊GRP78基因序列,本试验通过慢病毒载体pCD513B构建了包含GRP78的全长cDNA的过表达载体,并用慢病毒干扰载体pCD513B-U6针对GRP78基因构建了shRNA干扰序列以及用于干扰对照的包含同长度无意义序列片段的干扰载体。把穿梭质粒和包装质粒一起转染HEK293细胞,包装并生产对应的慢病毒。稳定的克隆体系通常可以生产每毫升107转导单位(107 IU/mL)的病毒上清液。将慢病毒感染山羊子宫内膜上皮细胞(EEC)。通过RT-PCR和western blotting方法来检测Grp78的表达情况。试验结果如下:1.通过软件对Grp78基因进行序列分析,得出Grp78的CDS区共编码655个氨基酸,其相对分子质量为72397.0 u,理论等电点PI为5.07。2.构建了重组慢病毒过表达载体质粒pCD513B-Grp78。将其酶切鉴定,经琼脂糖凝胶电泳获得8100 bp和2300 bp大小的两个特异性片段,表明重组载体构建成功。3.以Grp78基因的ORF区作为shRNA的靶基因,设计并合成4对具有短发夹结构的两条寡核苷酸序列,经由退火得到互补的双链,然后克隆到慢病毒载体质粒pCD513B-U6上,构建Grp78基因重组慢病毒干扰载体并将其命名为pCD513B-U6-shRNA-Grp78。通过设计引物对pCD513B-U6-shRNA-Grp78载体进行PCR扩增鉴定,琼脂糖凝胶电泳实验得到350 bp大小的片段证明Grp78慢病毒干扰载体构建成功。4.将包装质粒和经鉴定正确的重组慢病毒载体质粒共同转染HEK 293细胞,生产慢病毒。5.将得到的Grp78过表达和干扰病毒感染山羊子宫内膜上皮细胞,结果证明过表达病毒使该细胞Grp78蛋白表达水平明显升高,干扰病毒则能够在mRNA水平上显著抑制其表达,干扰效率在70%左右。针对山羊Grp78过表达和shRNA重组慢病毒载体制备成功,为进一步研究Grp78的生理功能的研究奠定了基础。
[Abstract]:Endoplasmic reticulum (ER) is an important organelle closely related to protein processing and calcium storage. Once there is a calcium homeostasis in the endoplasmic reticulum or the accumulation of unfolded proteins and misfolded proteins, endoplasmic reticulum stress will be induced. Furthermore, unfolded protein response pathway was used to enhance the resistance and adaptability of cells to injury. Glucose-regulated protein 78 (Glucose-regulated protein78,GRP78), also known as BiP/HSPA5, is the central regulator of endoplasmic reticulum function. Its changes are generally regarded as stress markers of endoplasmic reticulum and the initial reaction of unfolded protein. According to the goat GRP78 gene sequence provided in NCBI, a full-length cDNA expression vector containing GRP78 was constructed by lentivirus vector pCD513B. Lentivirus interference vector pCD513B-U6 was used to construct the shRNA interference sequence for GRP78 gene and the interference vector containing meaningless sequence fragments of the same length for interference control. Shuttle plasmids and packaging plasmids were transfected into HEK293 cells to package and produce the corresponding lentivirus. A stable clone system can normally produce viral supernatants per milliliter of 107 transduction units (107 IU/mL). Infection of goat endometrial epithelial cell (EEC). With lentivirus The expression of Grp78 was detected by RT-PCR and western blotting. The results are as follows: 1. The sequence analysis of Grp78 gene showed that the CDS region of Grp78 encodes 655 amino acids with a relative molecular weight of 72397.0 uand a theoretical isoelectric point PI of 5.07.2. The recombinant lentivirus overexpression vector pCD513B-Grp78. was constructed. Two specific fragments of 8100 bp and 2300 bp were obtained by agarose gel electrophoresis, indicating that the recombinant vector was successfully constructed. Using the ORF region of Grp78 gene as the target gene of shRNA, four pairs of oligonucleotide sequences with short hairpin structure were designed and synthesized. After annealing, complementary double strands were obtained and cloned into lentivirus vector pCD513B-U6. Construction of Grp78 Gene Recombinant Lentivirus interference Vector and its name pCD513B-U6-shRNA-Grp78. The pCD513B-U6-shRNA-Grp78 vector was amplified by PCR with designed primers. The agarose gel electrophoresis showed that the Grp78 lentivirus interference vector was successfully constructed by agarose gel electrophoresis with the size of 350 bp. The packaging plasmid and the identified recombinant lentivirus vector plasmid were co-transfected into HEK 293 cells to produce lentivirus. The overexpression of Grp78 and interference virus infection of goat endometrial epithelial cells showed that the overexpression of Grp78 protein was significantly increased by the overexpression virus, and the interference virus could significantly inhibit the expression of Grp78 protein at the mRNA level. The interference efficiency is about 70%. The over expression of goat Grp78 and the preparation of shRNA recombinant lentivirus vector were successful, which laid a foundation for further study on the physiological function of Grp78.
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S827

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本文编号：2417446