表达基因Ⅶ型新城疫病毒F或HN糖蛋白的重组马立克氏病毒构建及其免疫效力试验

发布时间：2019-01-29 06:37

【摘要】：新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的一种高度接触性传染病,给世界养禽业带来巨大的经济损失。当前,Ⅶ型NDV是在中国、日本、韩国等地呈优势流行的基因型。由于常规NDV疫苗毒株与当前流行的NDV毒株分属于不同基因型,导致免疫鸡群仍然时常发生非典型新城疫,因此有必要研制与流行株基因型匹配的新型疫苗。本研究以马立克氏病病毒(Marek's disease virus, MDV) CVI988/Rispens疫苗毒株为载体,分别构建表达基因Ⅶ型NDV主要保护性抗原F和HN蛋白的重组病毒,并对这两株重组病毒的免疫保护效果进行评价,为基因Ⅶ型NDV的防控提供新型疫苗。为了使目的基因在重组MDV中高效表达,本研究首先对目的基因的启动子进行了筛选。分别构建含有Pec和CMV两个启动子的绿色荧光蛋白(GFP)重组质粒,转染DFl细胞,通过观测荧光强度以及western-blot试验来判定两个启动子的活性,结果显示CMV启动子的活性强于Pec启动子。采用RT-PCR扩增基因Ⅶ型NDV(DT-2014)的F和HN基因,并分别克隆入含有CMV启动子的pEASY TM-M1表达载体中,阳性质粒命名为pEASY-M1-F和pEASY-M1-HN。扩增F、HN基因的表达盒与本室构建的含有MDV CVI988/Rispens疫苗毒株sorfl/sorf2序列的pU/D质粒连接,得到的转移载体命名为pU/D-F、pU/D-HN。将转移载体pU/D-F和pU/D-HN分别与表达GFP的重组MDV (rMDV-GFP)的基因组共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。通过有限稀释的方法获得不含GFP的能稳定表达相对应F、HN基因的重组病毒昱rMDV-F和rMDV-HN。对获得的重组病毒rMDV-F和rMDV-HN进行聚合酶链式反应(PCR)、免疫印迹试验(Western- Blot)、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,确定新城疫病毒的F、HN基因在马立克病毒中插入正确,且能够稳定表达。本研究还评价了rMDV-F以及rMDV-HN两株重组病毒对基因Ⅶ型NDV强毒株DT-2014和MDV超强毒株RBIB的免疫保护效力。在重组病毒对NDV的免疫保护试验中,100只1日龄SPF鸡随机分成5组,依次为rMDV-F免疫组、rMDV-HN免疫组、弱毒疫苗免疫组、攻毒对照组以及空白对照组。前2组分别于1日龄颈部皮下接种5000噬斑形成单位(PFU)的rMDV-F或rMDV-HN重组病毒；弱毒疫苗组参照疫苗推荐剂量在7日龄滴鼻点眼免疫LaSota弱毒疫苗,21日龄时对除空白对照组外的其余4组用105EID50的DT-2014毒株攻毒,攻毒后连续观察7天,结果显示攻毒对照组的死亡率为100%,同各免疫组之间的差异极显著。重组病毒和弱毒疫苗均能在面临NDV攻击时对鸡群提供有效的保护,其中rMDV-F免疫组的保护率为85%,rMDV-HN免疫组的保护率为80%,弱毒疫苗免疫组的保护率为90%；针对各组免疫后抗体增长的检测结果显示两个重组病毒免疫组自免疫后抗体水平持续升高,LaSota弱毒疫苗于7日龄免疫,免疫一周后弱毒疫苗组抗体水平迅速增高。在重组病毒对MDV的免疫保护试验中,两个重组病毒对MDV RBIB强毒株的攻击都能够提供完全的保护,保护效力和CVI988/Rispens疫苗毒株相当。综上所述,本次试验成功构建了两株重组病毒rMDV-F和rMDV-HN,在面临新城疫强毒株攻击时对SPF鸡能够提供有效的保护,为ND的防制提供了新型疫苗。
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【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

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本文编号：2417743