通城猪与大白猪猪肝羧酸酯酶表达谱与品种差异研究

发布时间：2019-02-23 21:33

【摘要】：猪肝羧酸酯酶(pig liver esterase,PLE),属于丝氨酸水解酶,是由多种同工酶组成的酶家族,各同工酶之间基因序列高度同源。由于在催化底物水解时具有高度的立体选择性和高度酶活性,PLE成为有机化学合成领域水解酶的主角,而PLE作为药物代谢酶角色的研究很少。本课题组前期研究结果提示:PLE主要成员之一PLE1可催化水解某些磺胺类药物,PLE同工酶活性存在差异,不同品种猪PLE同工酶丰度存在差异。受PLE表现出的高度水解活性、以及人羧酸酯酶的表达水平呈显著年龄相关性且已成为临床用药依据事实的启发,同时基于本课题的前期研究,系统比较研究不同品种和不同年龄猪PLE同工酶丰度和总表达量差异,可望为猪临床合理用药提供必要的理论依据。本研究选取国家重点保护品种通城猪和外来优良瘦肉型品种大白猪,进行PLE的品种差异研究;参考研究人羧酸酯酶表达谱的年龄段,选取8日、1月、3月、成年(6~7月)四个年龄段猪,每个年龄段选取3头三代以内无血缘关系的猪进行PLE表达谱研究。由于PLE同工酶之间的基因和氨基酸序列高度同源,导致RT-q PCR和WB无法区分各自的m RNA和蛋白质,因此,本研究先根据同工酶保守区的核苷酸序列和氨基酸序列,分别设计RT-q PCR通用引物和制备通用抗体,检测PLE同工酶的m RNA和蛋白质总表达水平,同时用通用底物p-NPA测定肝脏S9的水解活性;再通过对肝脏中PLE同工酶ORF的大量克隆、测序,获得各同工酶出现的频率。结合PLE同工酶的m RNA水平和各同工酶出现的频率,得到各PLE同工酶表达丰度的数据。主要研究内容和结果如下:对1月龄和成年的两个品种猪,首先用RT-q PCR检测了11种组织中(分别是肝脏、心脏、脾脏、肾脏、肺脏、小肠、皮肤、肌肉、脑、淋巴结及胸腺)PLE同工酶m RNA总表达水平,结果表明无论年龄大小,PLE在两种猪肝脏中表达量均为最高,其次为肾脏、小肠和皮肤。肝脏是机体内主要的代谢解毒器官,同时PLE在肝脏中表达量也最高,因此,后续研究集中在猪肝脏中PLE上。RT-q PCR检测四个年龄段的两个品种猪肝脏中PLE同工酶m RNA总表达量。结果表明在通城猪和大白猪肝脏中PLE m RNA总表达量最高的年龄段分别是3月龄和1月龄,但总体上m RNA表达水平与年龄呈正相关。两个品种猪相比,除3月龄时通城猪的PLE m RNA表达水平比大白猪高,其它三个年龄段都是大白猪比通城猪的高。根据PLE同工酶靠近C末端的氨基酸保守序列设计合成两种多肽段,即PLE-C1-1:SKEAAKKPPKIKC和PLE-C2:CNTQAAKRLKGEE,两种多肽链等量混合后与KLH偶联,合成人工免疫原,免疫新西兰大耳兔,获得免疫血清,免疫血清用已偶联前述两种多肽的Sulfo Link凝胶柱进行免疫亲和层析纯化,得到效价高、特异性强的抗PLE通用抗体。等量混合同年龄段S9配制S9样品,WB检测S9样品中PLE总蛋白量,用Image J读取PLE和内参GAPDH的灰度值,计算两者的比值,得到四个年龄段通城猪和大白猪的比值依次是0.74,2.00,3.62,3.09和1.30,3.86,2.89,3.82,表明通城猪和大白猪PLE总蛋白表达量最高的年龄段分别是3月龄和1月龄,但总体上PLE蛋白表达水平与年龄呈正相关。两个品种猪相比,除3月龄时通城猪蛋白表达水平比大白猪高,其它的三个年龄段都是大白猪比通城猪高。PLE蛋白表达趋势与m RNA一致。在含1μmol/L p-NPA的PBS(50m M,p H7.2)反应体系中,检测肝脏S9样品的催化水解活性,测得四个年龄段通城猪和大白猪的S9样品比活依次是:0.19U,0.59U,0.9U,1.29U和0.4U,1.05U,1.22U,1.69U。PLE酶活性表现出随年龄增长而增强的趋势,与PLE的m RNA、蛋白质的表达趋势大体一致。两个品种猪相比,四个年龄段大白猪的肝脏S9对p-NPA的水解活性都比通城猪强。通过以上试验获得了PLE同工酶的总表达量,但无法获得同工酶各自表达丰度的数据。克隆每头猪肝脏中PLE同工酶各亚型的完整ORF。每头猪随机挑取至少20个阳性克隆进行测序,共测序800多个阳性克隆。经统计发现共克隆到108种PLE亚型,除去5种已报道的亚型,发现103种新亚型,重复出现的PLE亚型有50多种,在2头猪以上出现的有39种,其中有19种在两个品种的猪中出现。将出现频率高的54种亚型,按25个变异位点的氨基酸的相似度分为7大类(A~G),每一大类再用阿拉伯数字区分。统计发现两个品种猪肝脏中PLE同工酶表达丰度存在明显差异,大白猪的四个年龄段都是PLE-A1表达丰度最高,其次是PLE-B9;相反地,通城猪在前三个年龄段都是PLE-B9表达丰度最高,其次是PLE-A1(8日)或PLE-G5(1月和3月),而成年阶段是PLE-G3表达丰度最高。还发现PLE-G5和PLE-G3分别在两个品种猪的1月龄和成年期表达量大幅上升,提示PLE-G3和PLE-G5可能在两个品种猪的生长和成年阶段发挥重要作用。本研究发现通城猪和大白猪肝脏中PLE存在显著的品种差异,且其表达水平与年龄显著相关,这将导致相同兽药对不同年龄段和不同品种猪的疗效和毒副作用差异,因此,猪相关兽药的使用应根据猪的品种和年龄作出相应的调整。本研究获得的数据、以及利用本研究获得的大量PLE新亚进行水解兽药特性的后续研究结果,可为猪的临床合理用药提供必要的理论依据。
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【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S828

【参考文献】