GnRH1基因在鸡卵巢卵泡中的表达及调控作用分析

发布时间：2019-03-20 21:58

【摘要】：鸡的卵巢卵泡生长发育过程中,下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamic-pituitary-gonadal axis,HPGA)起到了非常重要的作用。下丘脑-垂体-性腺轴是一个完整而协调的神经内分泌系统,下丘脑通过分泌GnRH调节垂体LH和FSH的释放,从而控制性腺发育和性激素的分泌。本研究对GnRH1在鸡下丘脑和卵巢卵泡发育过程中的表达及其调控作用进行了初步分析。结果如下:1.qRT-PCR分析GnRH1基因在30、60、90、110和140日龄产蛋(140a)和未产蛋(140b)济宁百日鸡下丘脑和卵巢中的表达。结果显示:GnRH1 mRNA在下丘脑和卵巢中的表达从30日龄至140日龄未开产鸡均呈现出低高低高的趋势,60日龄与140日龄的表达量显著高于其他各个时期(P0.05),但两者之间差异不显著(P0.05);而在卵巢中,140日龄时GnRH1 mRNA相对表达量同下丘脑一样显著上调,但产蛋时却显著下调(P0.05),表现出与下丘脑不同的变化趋势。在开产后鸡的不同等级卵泡中,GnRH1 mRNA表达从SW(the small white follicle)到F5(the fifth large follicle)最后到F1(the first large follicle)和POF1(the first post-ovulatory follicle)中的表达差异未达到显著(P0.05)。2.免疫组化检测结果显示,GnRH1免疫阳性信号在未开产鸡(45d)和开产鸡(159d)卵巢膜细胞和颗粒细胞均被检测到,并且在未性成熟鸡的卵巢中,其主要在卵泡颗粒细胞层表达较高,而性成熟后则在膜细胞层表达较高。进一步分离性成熟卵巢卵泡的颗粒细胞和膜细胞,qRT-PCR结果表明,GnRH1 mRNA在卵泡膜细胞中的表达显著高于颗粒细胞(P0.05),与免疫组化结果一致。3.构建GnRH1基因的过表达载体,转染鸡原代膜细胞和颗粒细胞后,检测LHR,FSHR,PGR,ERα基因的表达量。结果显示,过表达GnRH1后,在颗粒细胞中,四个受体基因表达量均未出现显著变化;在膜细胞中,FSHR,PGR,ERαmRNA表达量未发生显著变化,而LHR m RNA表达量出现了显著下调(P0.01)。随后用LH和FSH激素处理膜细胞,检测GnRH1 mRNA的表达变化。结果显示,FSH激素对GnRH1的表达无显著影响,LH在浓度50 ng/mL时,GnRH1表达量显著上调(P0.05);继续加大LH的浓度发现,当LH浓度大于200 ng/mL时,GnRH1 mRNA表达量开始下调,而LHR mRNA表达量与LH浓度呈正相关。随后用50 ng/mL LH激素与GnRH1过表达共处理后,LHR表达量出现显著下调(P0.01)。4.在鸡等级卵泡膜细胞中过表达GnRH1基因并进行转录组测序,以未过表达GnRH1基因的膜细胞为对照,在过表达GnRH1的等级卵泡膜细胞中共筛选出了3997个差异表达基因,其中上调的差异表达基因1998个,下调的差异表达基因1999个,并对部分差异表达基因进行了qRT-PCR验证,包括表达量下调的基因CYP11A1,MMP11,MMP13,StAR,上调的基因FOXP1,FOXP2,VEGFA,USF1。对差异基因进行功能注释发现,它们被富集到FOXO、MAPK、TGF-beta、VEGF、GnRH、PPAR、Prosgesterone-mediated oocyte maturation、Toll-like receptor以及Wnt等信号通路。5.分析了GnRH1基因5′调控区长度3863bp片段的启动活性,双荧光素酶活性分析结果表明,在GnRH1基因启动子区3863bp长度内各个区域均未发现双荧光素活性,具体原因需进一步试验分析。总之,我们目前的研究结果表明:GnRH1作为卵巢内调节因子,接近开产时GnRH1mRNA的高表达有助于鸡性成熟的启动。在鸡卵巢膜细胞中,GnRH1可介导LH与LHR受体的结合,从而影响卵巢卵泡的发育和排卵。GnRH1可与多种因子协同调控鸡卵巢功能,在鸡性成熟的启动和卵巢卵泡发育中起着重要作用,具体调控机制有待深入研究。
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【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S831

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