乳酸杆菌丙酮酸水合酶基因组成型启动子的预测及功能鉴定

发布时间：2019-03-25 16:44

【摘要】：乳酸菌是公认的安全级(generally recognized as safe,GRAS)微生物,是动物肠道内重要的常在菌群,对维持肠道菌群平衡、改善便秘、防止腹泻以及提高机体免疫力具有重要作用。基于乳酸菌的多种益生特点,使其成为传递与表达外源抗原蛋白,进行肠道免疫的的重要宿主候选菌株。目前,乳酸菌级表达载体多以诱导型为主,由于表达异源蛋白的产量较低且不利于生产实践,从而限制了其应用。通过改造控制基因表达的顺式作用元件是提高蛋白表达量的有效途径,而启动子在细菌转录水平的调控中居于关键地位,因此稳定且可持续表达目的蛋白的组成型启动子是构建表达载体非常重要的表达元件。本研究以干酪乳杆菌为研究对象,通过干酪乳杆菌基因组c DNA微阵列分析,以寻找适用于异源蛋白表达的组成型启动子。将干酪乳杆菌在分别以葡萄糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、果糖、蔗糖、低聚果糖和棉籽糖为碳源的MRS培养基中连续培养,转接5次,提取细菌总RNA进行反转录,以16S RNA作为管家基因,进行全基因组c DNA微阵列分析。分析结果显示,以上述八种糖为碳源,干酪乳杆菌丙酮酸水合酶(enolase)基因皆为高表达基因,据此我们推测干酪乳杆菌丙酮酸水合酶基因含有组成型启动子。通过分析丙酮酸水合酶基因的上游基因序列并结合生物信息学软件确定了两段假定启动子序列,分别命名为P776和P342。分别将P776和P342与报告基因EGFP连接,然后连接到去除启动子的表达质粒pPG-T7g10-PPαT中,获得重组表达质粒pPG-P342EGFP和p PG-P776EGFP。为了验证所预测启动子的强弱,与原表达质粒pPG-T7g10-PPαT的HCE启动子进行了比较,将EGFP编码基因连入表达质粒pPG-T7g10-PPαT中,构建了重组表达质粒pPG-T7g10-EGFP。分别将重组表达质粒pPG-P342EGFP、pPG-P776EGFP和p PG-T7g10-EGFP经电转化转入Lactobacillus(L)casei 393感受态细胞,构建了重组菌pPG-P776EGFP/L.casei 393、pPG-P342EGFP/L.casei 393和pPG-T7g10-EGFP/L.casei 393,通过Western blot、荧光定量PCR、流式细胞技术及激光共聚焦等方法,检测报告基因EGFP的表达情况。构建的重组乳酸杆菌表达结果显示,由不同启动子组成的三株重组乳酸菌经激光共聚焦显微镜观察均可看到绿色荧光,Western blot检测EGFP获得了正确表达,大小约26k Da,说明预测的P342和P776均具有启动子活性。为比较P342和P776与原表达载体HCE启动子的活性强弱,提取对数生长期的三株重组菌RNA,以反转录产物c DNA为模板及氯霉素(Cm)基因为管家基因,进行相对定量PCR,实验结果显示,HCE:P342:P776 3种启动子的效率比分别为1:0.8:1.8;Western blot相对定量结果显示,三株重组菌中,p PG-P776EGFP/L.casei393目的蛋白的表达量最大;流式细胞检测显示,L.casei 393、p PG-P342EGFP/L.casei 393、pPG-P776EGFP/L.casei 393和pPG-T7g10-EGFP/L.casei 393的荧光强度分别为30.2%、38.5%、52.2%和45.2%;将p PG-P342EGFP/L.casei 393和pPG-P776EGFP/L.casei 393分别培养12h、18h、24h、30h和36h,Western blot检测显示,P342和P776启动子均可持续启动蛋白表达,培养24h时蛋白的表达量最大;分别以葡萄糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、果糖、蔗糖、低聚果糖和棉籽糖为碳源培养p PG-P342EGFP/L.casei 393和pPG-P776EGFP/L.casei393,经Western blot检测,结果显示组成型启动子P342和P776在不同糖类为碳源的培养基中均能启动报告基因EGFP的表达,其中P776启动子活性强于HCE启动子,本研究为构建乳酸菌级高效表达载体奠定了基础。
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【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.6

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