血清4型禽腺病毒的分离、致病性及其抗体间接免疫荧光方法的初步建立

发布时间：2019-03-27 10:19

【摘要】：禽腺病毒(Fowl Adenovirus,FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属。根据限制性酶切图谱以及血清交叉中和反应性,目前FAdV可分为5个种(A-E),12个血清型(血清型1-7、8a、8b、9-11)。流行病学研究发现,FAdV在世界范围内广泛分布,且对不同日龄的家禽均表现为易感。FAdV感染一般引起亚临床症状,而急性感染主要以包涵体肝炎、肝炎-心包积液综合症以及肌胃糜烂等为主。自2013年,国内多个省份相继爆发FAdV-4感染引起的包涵体肝炎-心包积液综合征,对国内养鸡业造成了严重的经济损失。为了解国内流行FAdV-4的分子特征、致病特性,并建立血清学诊断方法,本研究在开展FAdV分离鉴定的基础上,对部分FAdV-4禽腺病毒进行了全基因组测序、致病性研究,并对FAdV-4的纤突1基因进行了克隆表达,建立了检测FAdV-4抗体的间接免疫荧光方法。1.血清4型禽腺病毒FAdV-4分离鉴定及序列分析对2015年送检的疑似禽腺病毒感染的样品进行了病毒分离鉴定。结果从国内五个省份共分离、鉴定出了 9株禽腺病毒,其中一株为FAdV-8,其余均为FAdV-4,并对这8株FAdV-4分离株进行了序列分析。结果发现,与国内2013年FAdV-4分离株JSH13及JH13相比,这8株2015年FAdV-4分离株在基因ORF29均存在不同长度的缺失。其中一株病毒的ORF29有66个碱基对缺失,其余均缺失了 33个碱基对。与国外FAdV-4相比较,国内FAdV-4分离株还存在一个1961nt的缺失。另外,国内FAdV-4分离株的表面纤突蛋白1及纤突蛋白2与国外毒株的同源性分别为94.4%-94.7%及93.3%-94.5%。这些结果证明了国内目前正流行新型FAdV-4。揭示这些基因组中的缺失或突变可能是导致国内鸡群FAdV-4流行、爆发的原因。2.血清4型禽腺病毒FAdV-4的致病性为探究FAdV-4分离株的致病特性,本研究对3株FAdV-4分离株(2015年分离株SD15、JSCZ15,2013年分离株JH13)在体内外进行了测定。在鸡肝细胞上病毒生长特性表明,3毒株具有类似的病毒复制生长特性。SD15毒株在鸡肝细胞上的病毒滴度可达1×108TCID50/mL。通过肌肉接种103TCID50病毒量,感染SD15、JSCZ15及JH13鸡的致死率分别为80%,90%以及60%。泄殖腔排毒检测发现,感染鸡排毒一直持续到感染后第10天。病死鸡解剖可见典型的肝炎-心包积液综合症。肝脏组织切片HE染色可见肝细胞内嗜碱性核内包涵体,脂肪变性等特征病理变化。这些结果表明,这3个FAdV-4分离株为高致病性血清4型禽腺病毒。然这3个FAdV-4分离株的致病分子机制有待进一步探究。3.检测FAdV-4抗体的间接免疫荧光方法的初步建立对FAdV-4纤突蛋白F1进行了 PCR扩增,并利用商品化的重组酶ExnaseTM II快速重组连接,成功构建了 FAdV-4纤突蛋白F1真核表达载体pcDNA3.1-F1。利用抗FAdV-4的鸡阳性血清,分别通过间接免疫荧光和Western b1ot证明了 pcDNA3.1-F1真核载体的表达及表达产物纤突蛋白F1具有良好的抗原反应性。将转染pcDNA3.1-F1、且表达纤突蛋白F1的293T细胞作为抗原,建立了检测FAdV-4抗体的间接免疫荧光方法。特异性检测发现,该间接免疫荧光方法仅与所检测的抗FAdV-4抗体反应,而与所检测的抗鸡马立克病毒、禽白血病病毒、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性法氏囊炎病毒和鸡传染性支气管炎病毒等病毒抗体不反应。这些结果表明,基于纤突蛋白F1的检测FAdV-4抗体的间接免疫荧光方法具有一定的应用价值。
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【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.65

【参考文献】