铁结合蛋白进化分析，乳酸菌表面展示系统构建和产乙醇耐受性研究

发布时间：2019-05-14 08:35

【摘要】：铁作为生物有机体中必需的微量元素之一,在细胞代谢和生物生长发育中起着重要的作用,比如,体内氧的运输,电子的传递,细胞分化和细胞增殖,但是,机体内铁过量会导致机体内自由基提升,从而引起蛋白和DNA的氧化损害,造成细胞和组织的死亡。生物体内维持铁平衡的蛋白家族主要是铁蛋白和转铁蛋白家族,其中转铁蛋白家族中的乳铁蛋白同时作为抗菌活性肽在机体的免疫方面起着至关重要的作用。本研究从了解铁蛋白家族和转铁蛋白家族的进化及乳铁蛋白在家族进化过程中的产生和地位入手,将乳铁蛋白作为抗菌活性肽在食品级乳酸菌中进行表面表达,以期获得能够应用于饲料添加剂的高效活性益生菌,同时还对乳酸菌作为产乙醇菌耐受木质纤维水解液抑制物进行了探索。主要研究结果如下:1.铁蛋白家族的进化铁蛋白家族成员广泛分布在生物界中,而最典型的铁蛋白作为看家基因,在动物、植物和微生物界都有发现。本试验选取了248个来自病毒、古菌、细菌和真核生物的1181条蛋白序列进行研究,研究发现铁蛋白基因在哺乳动物和双子叶植物中大量存在,真菌中由于有其它铁平衡系统而很少存在,细菌、古菌中的铁蛋白基因也很可观;其中在原核生物中有3中类型的铁蛋白亚家族存在,而在真核生物中,只有典型的铁蛋白亚家族存在,但是它是由多种类型的亚基组成;特征序列模体的分析表明,维持铁结合和释放功能的氨基酸残基位点在生物进化中是保守存在的,同时每个亚家族和亚基类型的特征序列模体是可区分的,特别是在植物铁蛋白中发现了一个辨识度很高的特征模体;铁蛋白家族的系统进化树表明,相同亚家族或亚基的铁蛋白成员在进化树上是簇成一个进化分支的,不同的亚家族或亚基产生的主要原因是基因复制事件的发生,同时基因漂移和基因丢失也是产生家族新成员的因素。2.转铁蛋白家族的进化转铁蛋白家族作为转运铁离子维持铁平衡的重要蛋白家族主要存在于动物中,同时在绿藻中也有发现。本试验选取了具有代表性的动植物的100个物种,共371条转铁蛋白基因进行研究。研究表明,转铁蛋白结构基因在动物中广泛分布,但是其基因数目和类型在不同的动物分类族群中有很大的区别。一般说来,哺乳动物中基因组中有大量的转铁蛋白基因,而吸虫类动物仅少数的基因存在。其中,黑素转铁蛋白(Melanotransferrin)和血清转铁蛋白(Serotransferrin)广泛分布于脊椎动物,而类黑素转铁蛋白(Melanotransferrin-like)和I型类转铁蛋白(Transferrin-like 1)在所选非脊椎动物各物种中都有分布。本研究从少数几个植物物种的基因组中首次推断出转铁蛋白结构基因的存在,其分布在被子植物和蕨类植物中。通过比较其中6个重要家族成员的一级结构发现7个高度保守的特征模体。进化树的构建表明,基因复制、基因丢失以及基因漂移是推动转铁蛋白家族成员多样性的重要原因,同时,本试验提出各家族成员可能经历的进化事件。综上所述,本研究的发现有助于更全面深入地了解转铁蛋白家族基因的分布、特征模体和残基,及其家族的进化进程。3.乳铁蛋白在食品级乳酸菌中的表面表达以乳铁蛋白N端活性肽为目的基因,自溶素基因(acmA)作为细胞表面锚定结构域,抗菌肽基因nisI作为食品级筛选标记基因,利用重叠延伸PCR技术构建了pMG36-acmA-bLfcin-nisI穿梭表达载体,并将其电转化进入食品级乳酸乳球菌MG1614中,成功获得阳性转化子,通过测序结果证明成功构建了含有表面锚定基因和食品级抗性基因的能高效表达乳铁蛋白N端多肽的食品级乳酸乳杆菌MG1614(pMG36-acmA-bLfcin-nis I)。4.Lactobacillus casei 12AE1在合成水解液中发酵时对抑制物耐受性研究乳酸菌作为食品级菌株是酒精发酵生产中常见的易染菌,说明它耐受高浓度酒精、耐受水解液中pH的变化。基于L.casei 12AE1的酒精耐受性(10%的酒精浓度),碳源利用性和相对较高的电转化效率,本研究主要对水解液中存在的抑制物因子对其发酵生产乙醇的影响进行了探讨。研究表明,乳酸乳球工程菌L.casei 12AE1具有更好的木质纤维素抑制物耐受性;木质毒素作为木质纤维素水解液中的主要抑制因子对乳酸菌的生长产生了很大的影响,而高浓度葡萄糖的加入对乳酸菌的生长影响不大。通过HPLC分析发酵产物发现,L.casei 12AE1不仅能更好地生长,其乙醇产量也是最高。乳酸代谢路径在菌体发酵过程中依然发挥作用,而碳源的利用率在抑制物存在的水解液中有待提高。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S816.7

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本文编号：2476562