孕酮和雌二醇对牦牛输卵管糖蛋白及骨桥蛋白表达的影响

发布时间：2019-06-02 22:38

【摘要】：为了研究类固醇激素是否通过体细胞参于哺乳动物胚胎的发育调控。本文探讨了P_4(Progesterone,P_4)和雌二醇(Estradiol,E_2)对牦牛输卵管上皮细胞分泌输卵管糖蛋白(oviductin,Ovn)及骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)的影响。选用牦牛输卵管上皮细胞,采用组织块培养法和胰蛋白酶消化法获得牦牛输卵管上皮细胞,运用RT-PCR克隆和核酸测序获得牦牛骨桥蛋白cDNA;选取第4代牦牛输卵管上皮细胞,分别加入不同浓度的P_4和E_2,运用实时荧光定量(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和免疫荧光(Immunofluorescence technique,IF)分别分析P_4和E_2对体外培养牦牛输卵管上皮细胞Ovn和OPN表达的影响;用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,Elisa)测定不同浓度P_4和E_2作用后上清培养液中OPN的浓度。研究结果表明:(1)当P_4浓度为5~25 ng/mL时,随着P_4浓度的增加Ovn的表达量也逐渐增高;当P_4为25 ng/mL时,Ovn基因和蛋白表达量为最高;P_4浓度为50~200ng/mL时,Ovn基因和蛋白的表达量随着浓度的增加反而逐渐减少。(2)E_2可以提高牦牛输卵管上皮细胞的Ovn mRNA和蛋白相对表达量;当E_2浓度为25 ng/mL时,输卵管上皮细胞的Ovn mRNA和蛋白相对表达量最高,显著高于E_2浓度为10、50、100和200 ng/mL组;对照组Ovn mRNA和蛋白表达量最低。(3)牦牛的OPN与黄牛的同源性最高,达到99.2%;牦牛与山羊(Capra hircas)、绵羊(Ovis aries)、野猪(Sus scrofa)的相似性分别为93.8%、93.4%、73.6%;牦牛的OPN基因为1135 bp,包含完整开放阅读框837 bp,共编码278个氨基酸(GenBank登录号:KY402045)。(4)体外培养体系中添加不同浓度的P_4,OPN的mRNA和蛋白表达量均有所增加,且当P_4浓度为25 ng/mL时达到最高;添加不同浓度E_2 OPN的mRNA和蛋白表达量均有所下降,当E_2浓度为100 ng/mL时达到最低。(5)当P_4浓度为0~25 ng/mL时,OPN蛋白相对浓度随着P_4浓度的升高而增升高,且当P_4浓度为25 ng/mL时OPN的浓度达到最高,而后OPN蛋白相对浓度随着浓度的升高而下降;当E_2浓度为0~100 ng/mL时,OPN蛋白相对浓度随着浓度升高而下降,且当E_2浓度为100 ng/mL其浓度达到最低,而后当E_2浓度为200 ng/mL时其浓度又有所增加。
[Abstract]:In order to study whether steroid hormones are involved in the development of mammal embryos through somatic cells. The effects of P 鈮，

本文编号：2491466