猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp1a的原核表达及多克隆抗体和单克隆抗体的制备

发布时间：2019-07-04 07:00

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一种传染病,该病的主要特征是母猪出现繁殖障碍以及仔猪出现严重的呼吸道症状。自1987年在美国首次发现以来,在全球主要养猪国家广泛流行。1996年郭宝清等从猪场流产胎儿分离出该病毒,证实了我国存在PRRS的流行。在此后的时间里,该病在国内大部分地区流行并在部分地区呈上升趋势,给我国养猪业造成了极大的经济损失。PRRSV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。研究表明,该病毒感染机体后能够引起免疫抑制,形成持续性感染,具有抗体依赖性增强作用,并且病毒基因组遗传变异显著。病毒基因组编码的蛋白可划分为结构蛋白和非结构蛋白。非结构蛋白的功能主要作用在病毒RNA复制合成阶段并能够调控宿主对病毒的免疫反应过程。非结构蛋白1α (nsp1α)含有锌指结构域、木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶活性区域、C-末端延伸区等区域,能够抑制I-干扰素产生,在PRRSV逃逸机体免疫的过程中起到重要的作用。本研究扩增出nsp1α基因片段,构建原核重组质粒,表达重组蛋白作为免疫原,免疫动物后获得多克隆抗体及单克隆抗体。实验内容主要包括：1、PRRSV nsp1α原核表达及多克隆抗体的制备以真核重组质粒pcDNA3.1-nsp1α为模板,扩增出nsp1α片段,构建原核表达质粒pET32a-nsp1α,转化到大肠杆菌BL21(DE3)并优化培养条件。在37℃条件下,1mM诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达4h,菌液超声破碎后SDS-PAGE电泳表明重组蛋白以包涵体形式大量表达;大量诱导菌液并超声破碎,高速离心后得到包涵体,经过一系列缓冲液洗涤后用8M尿素缓冲液溶解包涵体,复性的包涵体作为免疫原免疫新西兰大白兔。免疫三次后,以包涵体复性液作为包被抗原,间接ELISA检测兔多克隆抗体血清,血清效价达到1：2048000以上。2、PRRSV nsp1α原核表达及单克隆抗体的制备以真核重组质粒pcDNA3.1-nsp1α为模板,扩增出nsp1α片段,构建原核表达质粒pET28a-nsp1α,转化大肠杆菌BL21 (DE3),在37℃条件下,1 mM诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达6h, SDS-PAGE蛋白电泳表明重组蛋白以包涵体形式大量表达,用8M尿素缓冲液溶解包涵体后,采用透析复性；复性的重组蛋白包被ELISA板,间接ELISA表明重组蛋白能够识别猪PRRSV阳性血清与阴性血清,具有较好的免疫学反应活性；重组蛋白免疫BALA/c小鼠,三次免疫后加强免疫一次,取小鼠脾脏细胞与SP2/0瘤细胞融合,以pET28a-nsp1α重组蛋白作为包被抗原,间接ELISA初次筛选阳性融合细胞,间接免疫荧光试验进一步筛选,最后得到稳定分泌nsp1α抗体的杂交瘤细胞；杂交瘤细胞注射小鼠腹腔,一周后收集腹水,间接ELISA检测效价达到1：512000。上述制备的nspla多克隆抗体和单克隆抗体进行Western blot、间接免疫荧光及免疫组化实验,均能够特异性识别真核重组蛋白pcDNA3.1-nsp 1α以及PRRSV BJ4株nspla天然蛋白。这为研制基于nspla检测的PRRSV诊断方法以及进一步研究nspla功能提供了研究基础。
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【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

【参考文献】