锌对原代培养肉鸡鸡胚热敏肝细胞的抗热应激效应及其分子机制研究

发布时间：2019-07-12 09:14

【摘要】：本研究通过四个试验,观测了在不同温度下锌对原代培养肉鸡鸡胚肝细胞抗氧化性能及相关的分子指标的影响,从细胞水平探讨了锌对肉鸡抗热应激效应及分子机制。试验一旨在通过建立可靠的肉鸡鸡胚热敏肝细胞模型,并观测肝细胞的持续活力,为后续研究锌对原代培养肉鸡鸡胚肝细胞抗热应激效应及分子机制奠定基础。本试验用14胚龄鸡胚分离得到鸡胚肝细胞,并接种到六孔培养板培养。台盼蓝染色显示,细胞活率高达95%;糖原染色结果显示,分离得到了纯度理想的鸡胚肝细胞;肝细胞可在培养到72h后汇合成单层,模型构建成功后肝细胞的活力可稳定维持3天,满足开展后续试验的条件。试验二旨在确定原代培养肉鸡鸡胚肝细胞最佳的锌添加水平及锌作用的最佳时间,为后续研究锌对原代培养肉鸡热敏鸡胚肝细胞的抗热应激效应及其分子机制奠定理论基础。本试验采用5×3两因子完全随机试验设计,肝细胞培养设5个添加锌水平(0、50、100、200和400μM硫酸锌形态的锌)与3个锌作用时间(12、24和48 h),共15个处理组,将同一处理的2个重复孔细胞收集到一个灭菌离心管中作为一个重复样品,每组6个重复。结果表明:在作用时间为12 h时、锌水平为50μM时铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)活性显著高于其它各处理组(P0.05);与对照组相比,加锌水平为50、100、200和400μM均显著上调了肝细胞金属硫蛋白(MT)mRNA的表达(P0.0001),而四个添加水平之间并无显著差异(P0.05)。根据以上结果,选择锌添加水平为50μM,作用时间为12h研究后续锌对肝细胞的抗热应激分子机制。试验三旨在研究热应激状态下肝细胞热休克蛋白(HSP70、90)mRNA相对表达量及培养上清乳酸脱氢酶(LDH)活性随培养时间的变化,以确定原代培养肉鸡鸡胚肝细胞受到热应激影响的最佳时间,为后续研究锌对原代培养肉鸡热敏鸡胚肝细胞的抗热应激效应及其分子机制奠定基础。试验采用2×5两因子完全随机设计。试验设2个鸡胚肝细胞培养温度(40℃常温和44℃高温)与5个处理时间(1、2、4、6和8小时),共10个处理组。将同一处理的2个重复孔的细胞培养液和细胞收集到一个灭菌离心管中作为一个重复样品,每组6个重复。结果表明:培养时间分别为4、6、8 h时,与常温组相比,高温组显著提高肝细胞培养液LDH酶活(P0.0001);在热应激(44℃)状态下,培养4 h以内,随着培养时间的增加肝细胞HSP70 mRNA相对表达量显著升高(P0.034);在热应激状态下肝细胞HSP 90 mRNA相对表达量随培养时间的增加而显著升高(P0.023),在培养6 h达到最高,后又显著降低(P0.0008)。根据以上结果,选择热应激时间为4、6 h作为后续锌对肝细胞的抗热应激分子机制。试验四采用2×3×2三因子完全随机设计。设2个鸡胚肝细胞培养温度(40℃和44℃)、3种锌源处理(不添加锌、50μM ZnSO4以及50μM中等鳌合强度Zn-Lys)与2个热应激处理时间(4 h与6 h),共12个处理组,每组6个重复。结果表明,在常温情况下,与未添加锌组相比,添加ZnSO4提高了肝细胞CuZnSOD酶活(P=0.0048)。在高温情况下,添加Zn-Lys组肝细胞CuZnSOD酶活显著高于未添加锌组及ZnSO4组(P=0.049);与常温相比,高温显著升高了肝细胞MDA含量(P=0.006)。与未加锌组相比,加锌均能显著提高肝细胞MT mRNA的表达量(P0.035);与常温组相比,高温显著提高了肝细胞HSP70 mRNA的表达量(P0.0001)。在高温情况下,与未加锌组相比,添加ZnSO4组显著降低了HSP70 mRNA表达量(P0.05);在常温情况下,添加Zn-Lys组HSP90 mRNA的表达量显著低于未加锌和加ZnSO4组(P0.005)。在高温情况下,处理4h时,ZnSO4组HSP90 mRNA的表达量显著低于未加锌组和Zn-Lys组(P0.0003);与常温组相比,高温显著提高了肝细胞HSP70蛋白表达(P0.0001)。在高温处理6h时,添加ZnSO4组及ZnLys组显著下调了肝细胞HSP70蛋白表达(P0.0001)。综上所述,加锌可提高肉鸡鸡胚肝细胞抗氧化能力;热应激引起肉鸡鸡胚肝细胞氧化损伤;加锌缓解了热应激引起肉鸡鸡胚肝细胞氧化损伤。
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图片说明：技术路线图
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图片说明： 培养 48 h 培养 72 h图 2.1 肝细胞形态学观察细胞糖原染色鉴定细胞糖原染色鉴定结果见图 2.2。肝细胞胞质内含有丰富的糖原，糖原染成紫红色。微镜观察到阳性组视野中细胞 90%以上呈紫红色，而阴性组并未，表明分离培养的肝细胞有较高的纯度。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S831.5

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本文编号：2513613