猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR诊断方法的建立及初步应用
发布时间：2019-07-18 11:47
【摘要】：自2014年美国首次报道猪Delta冠状病毒(PDCoV)以来,该病毒相继在我国一些猪场检测到,由于其发病症状和病理剖检与猪流行性腹泻(PED)极其相似,且易出现混合感染,临床很难区分,给养殖业造成严重经济损失,因此建立能够同时检测且能区分这两种病毒感染的诊断方法,对于临床实践具有重要意义。根据GenBank中登录的PDCoV和猪流行性腹泻病毒(PEDV)基因序列,设计了2对分别用于扩增PDCoV N基因和PEDV M基因的目的片段的引物,通过对RT-PCR反应条件进行优化,建立了同时检测PDCoV和PEDV的双重RT-PCR检测方法,并对该方法进行了灵敏性、特异性和重复性研究。结果显示,该双重RT-PCR对PD-CoV和PEDV的最低检测量分别是3.14×10~3 copies/μL和3.88×10~4 copies/μL。该方法仅对PDCoV和PEDV检测为阳性,对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、博卡病毒(PBoV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪伪狂犬病毒(PRV)等猪常见的感染病毒的扩增均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。用建立的双重RT-PCR方法对111份临床样品进行检测,其中PDCoV阳性样品22份,阳性率为19.82%,PEDV阳性样品27份,阳性率为24.32%,PDCoV和PEDV共感染的样品数为10份,阳性率为9.01%。本试验所建立的双重RT-PCR方法能够快速、准确地对PDCoV和PEDV单一或混合感染的临床样品进行快速检测,为临床上对PDCoV和PEDV鉴别诊断和流行病学调查研究提供了新的技术手段。
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图片说明： 中国兽医科学第47卷图1PDCoV和PEDV单一和双重RT-PCR扩增Fig.1ThesingleandduplexRT-PCRproductsofPDCoVandPEDVM：DNA分子质量标准；1：PDCoV和PEDV的双重PCR扩增产物；2：PDCoV单重PCR产物；3：PEDV单重PCR产物；4：阴性对照M：DL1000DNAMarker；1：TheamplificationproductsofPEDVandPDCoV；2：TheamplificationproductofPDCoV；3：TheamplificationproductofPEDV；4：Negativecontrol图2多重RT-PCR的特异性试验Fig.2SpecificityoftheduplexRT-PCRforPEDVandPDCoVdetectionM：DNA分子质量标准；1：PDCoV和PEDV多重PCR扩增；2～7：分别是PDCoV、PEDV、TGEV、PBoV、PRRSV、PRV的PCR产物；8：阴性对照M：DL2000DNAMarker；1：TheduplexRT-PCRproductsofPDCoVandPEDV；2-7：ThePCRproductsofPDCoV，PEDV，TGEV，PBoV，PRRSVandPRV；8：Negativecontrol2.2PDCoV和PEDV双重RT-PCR的特异性试验分别以PDCoV和PEDV的单一及混合质粒，TGEV和PRRSV的cDNA，PBoV和PRV的DNA为模板，应用建立的方法进行多重RT-PCR扩增。结果显示，仅PDCoV、PEDV组能扩出特异性条带，且与目的片段大小相符合，而其他病毒均未扩增出条带（见图2）。图3多重RT-PCR的敏感性试验Fig.3SensitivitytestofduplexRT-PCRM：DNA分子质量标准；1～9：109～100copies/L；10：阴性对照M：DL2000DNAMarker；1-9：109～100copies/L；10：Negativecontrol图4双重RT-PCR的重复性试验Fig.4RepeatabilitytestofduplexRT-PCRofPDCoVandPEDVA、B和C：分别代表第一、三和五周的RT-PCR；M：DNA分子质量标准；1：PDCoV；2：PDCoVandPEDV；3：PEDV；4：阴性对照A，BandC：Thefirst，thirdandfifthweekofRT-PCR，respectively；1：PDCoV；2：PDCoVandPEDV；3：PEDV；
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图片说明： 中国兽医科学第47卷图1PDCoV和PEDV单一和双重RT-PCR扩增Fig.1ThesingleandduplexRT-PCRproductsofPDCoVandPEDVM：DNA分子质量标准；1：PDCoV和PEDV的双重PCR扩增产物；2：PDCoV单重PCR产物；3：PEDV单重PCR产物；4：阴性对照M：DL1000DNAMarker；1：TheamplificationproductsofPEDVandPDCoV；2：TheamplificationproductofPDCoV；3：TheamplificationproductofPEDV；4：Negativecontrol图2多重RT-PCR的特异性试验Fig.2SpecificityoftheduplexRT-PCRforPEDVandPDCoVdetectionM：DNA分子质量标准；1：PDCoV和PEDV多重PCR扩增；2～7：分别是PDCoV、PEDV、TGEV、PBoV、PRRSV、PRV的PCR产物；8：阴性对照M：DL2000DNAMarker；1：TheduplexRT-PCRproductsofPDCoVandPEDV；2-7：ThePCRproductsofPDCoV，PEDV，TGEV，PBoV，PRRSVandPRV；8：Negativecontrol2.2PDCoV和PEDV双重RT-PCR的特异性试验分别以PDCoV和PEDV的单一及混合质粒，TGEV和PRRSV的cDNA，，PBoV和PRV的DNA为模板，应用建立的方法进行多重RT-PCR扩增。结果显示，仅PDCoV、PEDV组能扩出特异性条带，且与目的片段大小相符合，而其他病毒均未扩增出条带（见图2）。图3多重RT-PCR的敏感性试验Fig.3SensitivitytestofduplexRT-PCRM：DNA分子质量标准；1～9：109～100copies/L；10：阴性对照M：DL2000DNAMarker；1-9：109～100copies/L；10：Negativecontrol图4双重RT-PCR的重复性试验Fig.4RepeatabilitytestofduplexRT-PCRofPDCoVandPEDVA、B和C：分别代表第一、三和五周的RT-PCR；M：DNA分子质量标准；1：PDCoV；2：PDCoVandPEDV；3：PEDV；4：阴性对照A，BandC：Thefirst，thirdandfifthweekofRT-PCR，respectively；1：PDCoV；2：PDCoVandPEDV；3：PEDV；
【作者单位】： 河南农业大学牧医工程学院;河南省动物性食品安全重点实验室;
【基金】：国家重点研发计划项目(2016YFD0500102) 河南省科技开放合作项目(152106000047)
【分类号】：S852.651
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图片说明： 中国兽医科学第47卷图1PDCoV和PEDV单一和双重RT-PCR扩增Fig.1ThesingleandduplexRT-PCRproductsofPDCoVandPEDVM：DNA分子质量标准；1：PDCoV和PEDV的双重PCR扩增产物；2：PDCoV单重PCR产物；3：PEDV单重PCR产物；4：阴性对照M：DL1000DNAMarker；1：TheamplificationproductsofPEDVandPDCoV；2：TheamplificationproductofPDCoV；3：TheamplificationproductofPEDV；4：Negativecontrol图2多重RT-PCR的特异性试验Fig.2SpecificityoftheduplexRT-PCRforPEDVandPDCoVdetectionM：DNA分子质量标准；1：PDCoV和PEDV多重PCR扩增；2～7：分别是PDCoV、PEDV、TGEV、PBoV、PRRSV、PRV的PCR产物；8：阴性对照M：DL2000DNAMarker；1：TheduplexRT-PCRproductsofPDCoVandPEDV；2-7：ThePCRproductsofPDCoV，PEDV，TGEV，PBoV，PRRSVandPRV；8：Negativecontrol2.2PDCoV和PEDV双重RT-PCR的特异性试验分别以PDCoV和PEDV的单一及混合质粒，TGEV和PRRSV的cDNA，PBoV和PRV的DNA为模板，应用建立的方法进行多重RT-PCR扩增。结果显示，仅PDCoV、PEDV组能扩出特异性条带，且与目的片段大小相符合，而其他病毒均未扩增出条带（见图2）。图3多重RT-PCR的敏感性试验Fig.3SensitivitytestofduplexRT-PCRM：DNA分子质量标准；1～9：109～100copies/L；10：阴性对照M：DL2000DNAMarker；1-9：109～100copies/L；10：Negativecontrol图4双重RT-PCR的重复性试验Fig.4RepeatabilitytestofduplexRT-PCRofPDCoVandPEDVA、B和C：分别代表第一、三和五周的RT-PCR；M：DNA分子质量标准；1：PDCoV；2：PDCoVandPEDV；3：PEDV；4：阴性对照A，BandC：Thefirst，thirdandfifthweekofRT-PCR，respectively；1：PDCoV；2：PDCoVandPEDV；3：PEDV；
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图片说明： 中国兽医科学第47卷图1PDCoV和PEDV单一和双重RT-PCR扩增Fig.1ThesingleandduplexRT-PCRproductsofPDCoVandPEDVM：DNA分子质量标准；1：PDCoV和PEDV的双重PCR扩增产物；2：PDCoV单重PCR产物；3：PEDV单重PCR产物；4：阴性对照M：DL1000DNAMarker；1：TheamplificationproductsofPEDVandPDCoV；2：TheamplificationproductofPDCoV；3：TheamplificationproductofPEDV；4：Negativecontrol图2多重RT-PCR的特异性试验Fig.2SpecificityoftheduplexRT-PCRforPEDVandPDCoVdetectionM：DNA分子质量标准；1：PDCoV和PEDV多重PCR扩增；2～7：分别是PDCoV、PEDV、TGEV、PBoV、PRRSV、PRV的PCR产物；8：阴性对照M：DL2000DNAMarker；1：TheduplexRT-PCRproductsofPDCoVandPEDV；2-7：ThePCRproductsofPDCoV，PEDV，TGEV，PBoV，PRRSVandPRV；8：Negativecontrol2.2PDCoV和PEDV双重RT-PCR的特异性试验分别以PDCoV和PEDV的单一及混合质粒，TGEV和PRRSV的cDNA，，PBoV和PRV的DNA为模板，应用建立的方法进行多重RT-PCR扩增。结果显示，仅PDCoV、PEDV组能扩出特异性条带，且与目的片段大小相符合，而其他病毒均未扩增出条带（见图2）。图3多重RT-PCR的敏感性试验Fig.3SensitivitytestofduplexRT-PCRM：DNA分子质量标准；1～9：109～100copies/L；10：阴性对照M：DL2000DNAMarker；1-9：109～100copies/L；10：Negativecontrol图4双重RT-PCR的重复性试验Fig.4RepeatabilitytestofduplexRT-PCRofPDCoVandPEDVA、B和C：分别代表第一、三和五周的RT-PCR；M：DNA分子质量标准；1：PDCoV；2：PDCoVandPEDV；3：PEDV；4：阴性对照A，BandC：Thefirst，thirdandfifthweekofRT-PCR，respectively；1：PDCoV；2：PDCoVandPEDV；3：PEDV；
【作者单位】： 河南农业大学牧医工程学院;河南省动物性食品安全重点实验室;
【基金】：国家重点研发计划项目(2016YFD0500102) 河南省科技开放合作项目(152106000047)
【分类号】：S852.651
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