禽腺病毒血清4型的分离鉴定及遗传演化分析

发布时间：2019-07-20 09:27

【摘要】：本研究从辽宁发病鸡群采集的病料经SPF鸡胚接种传代分离病毒,并其进行了PCR和测序分析鉴定。结果,从病料中经SPF鸡胚接种传代分离出一株禽腺病毒,经PCR和测序分析鉴定确定该分离株为禽腺病毒C种、血清4型,命名为LN160130;通过对52 k和hexon基因同源性比对,LN160130与我国近年报道的禽腺病毒血清4型同源性最高,52 k和hexon基因的同源性均为100%;与国外流行的血清4型毒株相比,LN160130的52k基因同源性99.3%~100%,hexon基因同源性98.7%~99.8%。遗传演化分析结果表明,LN160130分离株与我国禽腺病毒血清4型流行毒株在同一分支内,而与国外禽腺病毒血清4型毒株不在同一分支,存在遗传差异,说明中国流行的血清4型禽腺病毒有自身地域特点。
【图文】：

第6期王娟等：禽腺病毒血清4型的分离鉴定及遗传演化分析图1禽腺病毒的PCR检测Fig.1PCRdetectionoffowladenovirus1：用引物对52k-fw＋52k-rv进行PCR扩增；2：用引物对HF2＋HR2进行PCR扩增；M：DNA分子质量标准；a：组织样品；b：鸡胚尿囊液1：PCRamplificationbyprimers52k-fw＋52k-rv；2：PCRamplificationbyprimersHF2+HR2;M：DL2000DNAMarker;a：Tissuesamples;b：Chickenembryoallantoicfluid组织研磨仪充分研磨后加入适量无菌PBS，反复冻融3次，10000r/min离心10min。取上清液经0.22m滤器过滤，将过滤后的无菌病毒液接种6.5日龄SPF鸡胚卵黄囊中，，接种剂量为每胚0.2mL，于37℃孵化箱孵育。弃去24h内死亡的鸡胚。37℃培养4d后无菌条件下收获鸡胚尿囊液，置－70℃储存备用。此鸡胚尿囊液为病毒分离物的F1代，按上述方法将病毒在SPF鸡胚连续传代3代后进行PCR鉴定。PCR鉴定为阳性的病毒分离物经有限稀释法在SPF鸡胚连续传代3代进行纯化。1.6病毒分离物的PCR检测及序列测定取含有病毒分离物的鸡胚尿囊液200L，用于病毒基因组DNA的提取，同前述方法进行PCR鉴定。PCR产物经胶回收试剂盒回收纯化，回收产物克隆至pMDI8－T载体，对PCR鉴定为阳性的克隆送北京六合华大基因科技有限公司测序。1.7血凝试验按常规方法制备1％鸡红细胞，取含有病毒分离物的鸡胚尿囊液按常规方法进行血凝试验［16］，以检测病毒分离物是否含有具有血凝活性的病原微生物。1.8序列比对及遗传演化分析PCR扩增得到的52k和hexon基因序列经BLAST在线比对和Lasergene软件分析（DNAStar），与国内外FAdV毒株的52k和hexon同源基因序列进行同源性比对，利用分子生物学软件MEGA（6.0版本）对分离毒株和参考毒株进行遗传演化分析，用最大似然法（MaximumLi

第6期王娟等：禽腺病毒血清4型的分离鉴定及遗传演化分析图1禽腺病毒的PCR检测Fig.1PCRdetectionoffowladenovirus1：用引物对52k-fw＋52k-rv进行PCR扩增；2：用引物对HF2＋HR2进行PCR扩增；M：DNA分子质量标准；a：组织样品；b：鸡胚尿囊液1：PCRamplificationbyprimers52k-fw＋52k-rv；2：PCRamplificationbyprimersHF2+HR2;M：DL2000DNAMarker;a：Tissuesamples;b：Chickenembryoallantoicfluid组织研磨仪充分研磨后加入适量无菌PBS，反复冻融3次，10000r/min离心10min。取上清液经0.22m滤器过滤，将过滤后的无菌病毒液接种6.5日龄SPF鸡胚卵黄囊中，接种剂量为每胚0.2mL，于37℃孵化箱孵育。弃去24h内死亡的鸡胚。37℃培养4d后无菌条件下收获鸡胚尿囊液，置－70℃储存备用。此鸡胚尿囊液为病毒分离物的F1代，按上述方法将病毒在SPF鸡胚连续传代3代后进行PCR鉴定。PCR鉴定为阳性的病毒分离物经有限稀释法在SPF鸡胚连续传代3代进行纯化。1.6病毒分离物的PCR检测及序列测定取含有病毒分离物的鸡胚尿囊液200L，用于病毒基因组DNA的提取，同前述方法进行PCR鉴定。PCR产物经胶回收试剂盒回收纯化，回收产物克隆至pMDI8－T载体，对PCR鉴定为阳性的克隆送北京六合华大基因科技有限公司测序。1.7血凝试验按常规方法制备1％鸡红细胞，取含有病毒分离物的鸡胚尿囊液按常规方法进行血凝试验［16］，以检测病毒分离物是否含有具有血凝活性的病原微生物。1.8序列比对及遗传演化分析PCR扩增得到的52k和hexon基因序列经BLAST在线比对和Lasergene软件分析（DNAStar），与国内外FAdV毒株的52k和hexon同源基因序列进行同源性比对，利用分子生物学软件MEGA（6.0版本）对分离毒株和参考毒株进行遗传演化分析，用最大似然法（MaximumLi
【作者单位】： 东北农业大学生命科学学院;东北农业大学动物科学技术学院;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室;
【基金】：蛋鸡体系项目(CARS-41-K12) 国家科技支撑计划项目(2015BAD12B03) 重点实验室基本科研项目(SKLVBP2015008)
【分类号】：S852.65

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本文编号：2516634