TGF-β1在奶牛乳腺纤维化过程中的作用及分子机制

发布时间：2019-08-03 14:48

【摘要】：奶牛乳腺炎和乳腺纤维化是奶牛的最常见的疾病之一,在国内外均有较高的发病率和感染率,严重时可发展为乳腺硬化导致奶牛淘汰,给奶牛业造成严重的经济损失。奶牛乳腺纤维化通常由久治不愈的乳腺炎迁延所致,不同的病原菌引起的临床型和隐型乳腺炎均可引起乳腺不同程度的纤维化。结缔组织的过度增生、细胞外基质蛋白(extracellular matrix protein,ECM)堆积及上皮细胞间质样转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)均可参与多种组织器官的纤维化过程。虽然大量研究已证明转化生长因子1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)与多种器官和组织的慢性炎症及由此产生的EMT有密切关系,但TGF-β1在奶牛乳腺纤维化中是否发挥功能及其作用机制尚不明确,本研究旨在探究TGF-β1在奶牛乳腺纤维化发生过程中的作用及其机制。本研究首先通过蛋白印迹技术(western blot)检测发现TGF-β1在炎性奶牛乳腺组织中的蛋白表达水平明显高于正常乳腺组织;酶联免疫吸附试验(ELISA)和western blot检测进一步发现TGF-β1在脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)和脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)诱导的炎性乳腺上皮细胞中的分泌和蛋白表达水平均高于正常乳腺上皮细胞,表明TGF-β1参与在奶牛乳腺的炎性应答过程。为了探究TGF-β1在奶牛乳腺炎及乳腺纤维化过程中的作用,本研究选用外源性TGF-β1处理奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs),通过一系列分子生物学方法研究其对BMECs的生物学功能的影响。本研究首先通过相差显微镜和F-actin荧光染色对细胞形态学观察发现,TGF-β1可诱导BMECs发生EMT;进一步通过western blot,实时荧光定量PCR,细胞免疫荧光等技术对BMECs中EMT标志分子如α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、E-钙黏素、波形蛋白、纤连蛋白和ECM蛋白包括I型胶原蛋白、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2和MMP9等从基因和蛋白水平进行了检测,结果发现,TGF-β1处理BMECs促进α-SMA和波形蛋白等的表达,但抑制E钙粘素的表达。此外,TGF-β1可促进I型胶原蛋白、MMP2、和MMP9等ECM蛋白的表达,表明TGF-β1可诱导BMECs发生明显的EMT及ECM蛋白的过度表达。随后,本研究通过western blot及细胞免疫荧光等实验对TGF-β1诱导BMECs发生EMT的分子机制进行研究,结果发现,TGF-β1处理BMECs可激活Smad2,并导致Smad4从胞质移位到胞核中,表明TGF-β1处理激活BMECs内的TGF/Smad信号通路。TGF-β1受体抑制剂能够抑制该通路的激活,而且TGF-β1诱导BMECs发生的EMT和ECM蛋白积累同时受到抑制,表明TGF-β1通过TGF/Smad信号通路参与其诱导的上皮细胞EMT和ECM蛋白累积,进而参奶牛乳腺炎迁延导致的乳腺纤维化过程。最后,通过小鼠模型对TGF-β1可能导致的乳腺纤维化进行体内研究。病理组织切片分析发现,小鼠乳腺导管每3天注射1次TGF-β1,共4次注射后可诱导小鼠乳腺发生明显的炎性浸润及不同程度的组织纤维化;经单次注射和对照组的小鼠乳腺均未见异常。结果表明,TGF-β1持续刺激可诱导乳腺发生炎症并伴随纤维化的发生。综上所述,TGF-β1在炎性奶牛乳腺组织和体外诱导的炎性乳腺上皮细胞中的表达水平均明显增高,高表达的TGF-β1可通过TGF/Smad信号通路诱导乳腺上皮细胞发生间质样转化及ECM蛋白生成的增加,进而参与奶牛乳腺炎迁延不愈导致的乳腺纤维化过程。
【图文】：

MT 是另一种形式的转分化，是脊椎动物胚胎发育时期一种被广泛认同的细胞(Hay 1995)。组织损伤修复中成纤维细胞的生成(Strutz et al. 1995)(Iwano e、 上 皮 癌 中 癌 细 胞 的 转 移 都 与 之 相 关 (Kiemer et al. 2001)(Janda etVincent-Salomon et al. 2003)(Xue et al. 2003)。现已发现的 EMT 现象包括视网膜转化为晶状体上皮细胞(Eguchi et al. 1993)(Del et al. 2003)、白色脂肪细胞转化肪细胞(Cinti 2002)、内皮细胞转化为血管平滑肌细胞(Frid et al. 2002)。从最纯讲，一个终末分化上皮细胞的 EMT 产生一个组织成纤维细胞(Iwano et al. 200

β 家族是通过与一个由 I 型受体和 II 型受体构成的跨膜受体复合物结合号传递。家族内的不同配体有与其匹配的特定受体复合物，均由不同 II 型受体构成。脊椎动物中现已发现七种 I 型受体与五种 II 型受体(M些受体具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，与配体结合后刺激受体复合物形氨酸和丝氨酸富集区在 II 型受体作用下发生磷酸化(De 2004)激活，TGF-β 信号通路的胞内调控受体 R-Smad（receptor-regulated S磷酸化(Graff et al. 1996; Hoodless et al. 1996; Liu et al. 1996; Zhang et a2、Smad3。随后磷酸化 R-Smad 与 Smad 家族中的另一成员 Co-Smad（cmad），，即 Smad4 形成复合物(Lagna et al. 1996; Zhang et al. 1996)。这种积累，通常与其他转录因子共同对基因表达进行正向或负向调控(Fen受到配体刺激前，Smad4 均匀分布于细胞核与细胞质中，R-Smad 更倾。受到配体刺激后，两者都在细胞核内聚集(Dijke et al. 2006)。另hibitory Smads），包括 Smad6 及 Smad7，他们通过阻碍受体复合物(Ebihi et al. 2004)、R-smad/Co-Smad 复合物形成(Hata et al. 1998)或阻碍 S(Bai et al. 2000)对 TGF-β 信号通路进行负反馈调节。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.23

【参考文献】

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6 张蕾;谢席胜;李飞燕;张和平;刘畅;樊均明;;红景天甙对低氧诱导肾小管上皮细胞转分化的作用研究[J];四川大学学报(医学版);2010年01期

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本文编号：2522628