检测两型鸭圆环病毒双重PCR方法的建立和分子流行病学调查

发布时间：2019-08-13 10:44

【摘要】：鸭圆环病毒(Duck circovirus,Du CV)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus),基因组为单股共价闭合环状DNA,整个基因组大小约为2kb。鸭圆环病毒主要侵害病鸭的胸腺、法氏囊等免疫器官。鸭感染Du CV后表现为生长发育障碍、生长停滞,在出壳几周内发病,生长停滞和羽毛形状失常。近年来实验室建立了检测鸭圆环病毒的PCR方法和ELISA方法,但至今没有快速对鸭圆环病毒的分型检测方法。本实验利用两型鸭圆环病毒Cap蛋白基因序列的特异性对两型鸭圆环病毒分型。本研究主要进行了如下工作:1.检测两种基因型鸭圆环病毒双重PCR方法的建立Du CV存在两个基因型,两型Du CV的Cap基因核酸序列同源性在78%左右,二者之间的Cap蛋白序列的同源性只有77.6%左右,抗原表位预测分析表明二者之间也存在较大差异。而根据Du CV基因组同源性分型结果和Cap蛋白序列的分型结果基本一致,因此,我们选择Cap蛋白对Du CV进行分型鉴定。通过对从Genbank上下载的56个Du CV序列进行同源性分析,结合两个基因型Du CV Cap基因比对结果,设计了四条特异性引物,并对PCR反应条件进行了优化,建立了双重PCR检测方法。研究结果表明,该方法特异性强,能够对两型Du CV进行分型检测,且不受组织DNA和其他病原的影响;灵敏度高,最多能够检测到10个拷贝的鸭圆环病毒DNA,能够用于Du CV的分型检测和分子流行病学调查。2.利用双重PCR方法对山东地区养鸭场进行流行病学检测我们在不同时间采集了潍坊地区的8个鸭群共120只(每个鸭群15只)龄病死弱雏,采集其肝脏、胸腺、脾脏、法氏囊、肾脏、心脏等器官进行Du CV检测。使用建立的双重PCR检测方法进行分子流行病学检测,检测结果表明:3个鸭群(37.5%)检出Du CV-1和Du CV-2的混合感染,3个鸭群(37.5%)检出Du CV-2的单独感染。15只雏鸭被检出感染Du CV,其中3.33%(4/120)的雏鸭检出Du CV-1和Du CV-2的混合感染,9.17%(11/120)的雏鸭只感染Du CV-1或Du CV-2。采集泰安地区8个鸭群共120只雏鸭(每个鸭群15只)以同样的方法进行流行病学检测,没有检出Du CV感染。试验结果表明山东省老养殖区鸭群中存在较为严重的Du CV-1和Du CV-2混合感染的现象。3.对鸭圆环病毒是否垂直传播的初步探究王鑫等于2012年对潍坊地区鸭场进行Du CV检测,发现鸭场Du CV-1阳性率为27.32%,Du CV-2阳性率为42.81%。我们对Du CV感染阳性的某种鸭场中进行了跟踪检测,共收集了80枚未孵化的种蛋、30只孵化过程中出现的死胚和120只刚出壳的雏鸭作为检测对象,用本研究建立的多重PCR检测方法进行分子流行病学检测。种蛋中Du CV-2单独感染阳性率为2.50%,两型Du CV混合感染率为1.25%,没有检测到Du CV-1单独感染;死胚中Du CV-1单独感染率为3.33%,Du CV-2单独感染率为6.67%,两型Du CV混合感染率为3.33%;刚出壳雏鸭中Du CV-1单独感染率为2.50%,Du CV-2单独感染率为6.67%,两型Du CV混合感染率为3.33%。试验结果表明,该鸭场种蛋存在Du CV的感染,这也为Du CV的垂直传播提供了直接证据。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.32

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