PEDV变异株S、M蛋白原核表达及分泌抗S蛋白单抗杂交瘤细胞株的建立

发布时间：2019-08-13 19:44

【摘要】：本研究利用带有蘑菇凝素标签的原核表达载体(pET-LsLa),将猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)M基因的胞内区(99~227aa)插入载体,以期获得能可溶性表达的、大量且易于纯化的M蛋白。以本实验室构建的pET32a-PEDV(含S、M、N、ORF3基因)重组质粒为模板,设计去除目的基因信号肽和含有酶切位点的特异性引物,经PCR扩增得到目的基因tM,构建原核表达载体(pLsLa-tM),将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测及蛋白纯化,结果显示,融合蛋白LsLa-tM得到了大量表达,分子质量约为36 kD,与预期大小一致。包涵体形式产物通过2M乳糖亲和层析纯化得到纯净的目的蛋白(LsLa-tM),Western blot检测表明,纯化蛋白能保持其反应特异性。以新生乳猪增殖PEDV流行毒株ZMDZY-CH-11,通过差速离心纯化,得到纯化的PEDV全病毒,用吸光度测定法检测其总蛋白含量约19 mg/mL。利用本实验室构建的原核表达载体pGEX-PEDV-SA,在大肠杆菌BL21(DE3)中大量表达PEDV重组GST-SA蛋白,经GST柱亲和层析纯化后得到目的蛋白,Western blot检测表明该蛋白能和猪抗PEDV阳性血清发生特异性反应。将上述纯化PEDV全病毒作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,用纯化的PEDV重组M蛋白作为检测抗原;同时,以纯化的PEDV重组GST-SA蛋白作免疫原,免疫BALB/c小鼠,以纯化的PEDV全病毒作检测抗原,分别建立了检测抗PEDV抗体的间接ELISA方法。以PEDV重组M蛋白为检测抗原时,确定检测ELISA的最佳工作条件为:包被抗原量为1μg/孔/100μL,包被条件为4℃过夜,封闭物为5%脱脂奶,封闭时间为1.5 h,一抗稀释度为1:200,作用条件为37℃1.5 h;酶标二抗最佳工作浓度为1:6000;TMB显色时间为15 min。以PEDV全病毒为检测抗原时,最终确定ELISA的最佳工作条件为:包被抗原量为0.5625μg/孔/100μL,包被条件为37℃作用1 h后再4℃过夜;封闭物为5%脱脂奶,封闭时间为1 h;一抗稀释度为1:3200,作用条件为37℃1.5 h;酶标二抗最佳工作浓度为1:8000;TMB显色时间为15 min。通过常规方法进行细胞融合,用间接ELISA方法进行检测筛选,获得分泌抗S蛋白单抗的杂交瘤细胞孔。将其采用有限稀释法,进行3~4次亚克隆,最终获得3株能稳定分泌抗PEDV变异株S蛋白单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为2D1、1G6和2C10。单抗亚型鉴定均为IgM。间接ELISA检测3株细胞培养上清中抗体效价分别为1:1600、1:800、1:800,小鼠腹水中抗体效价分别为1:6400、1:3200、1:3200。单抗特异性试验结果显示,所制备的3株单抗与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)及猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)均无交叉反应。对其中一株(2D1)杂交瘤细胞的特性进行Western blot,结果表明,该单克隆抗体能特异性识别PEDV,但不能区分PEDV流行株和PEDV CV777疫苗株。ELISA检测中该单抗虽与PEDV流行株及PEDV CV777疫苗株全病毒都能反应,但两者的OD值有明显差异,因此可用作鉴别PEDV流行株和疫苗株的初步筛选试验。采用硫氰酸盐洗脱法测定该单抗相对亲和力(Ka)为4.0 mol/L,表明该单抗有相对较高的亲和力;间接免疫荧光中该单抗能识别天然病毒(PEDV CV777疫苗株)S蛋白。采用固定病毒稀释抗体法,按照Reed-Muench法计算该单抗的中和效价1:20,表明该单抗可能不能有效地中和PEDV病毒活性。尝试利用腹水单抗建立检测PEDV的双夹心间接ELISA方法,但经各种努力最终未获成功,具体原因还有待进一步研究。
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

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